金電極自組裝基因分子膜的制備及電化學檢測

黎媛萍 ，曾光明 ，湯 琳 ，陳耀寧 ，章 毅 ，劉 燦 ，李 貞 ，龐 婭

(1. 湖南大學 環境科學與工程學院，長沙 410082；2. 湖南城市學院 化學與環境工程學院，益陽 413000；3. 湖南大學 環境生物與控制教育部重點實驗室，長沙 410082)

電極修飾是電化學檢測過程中的關鍵步驟，自組裝膜修飾電極是基于分子的自組裝作用，在固體表面自然形成高度有序的單分子層膜[1-2]，在電極修飾的研究中備受關注。制備修飾電極的基因分子膜，一般是利用帶巰基(—SH)的化合物在金電極表面上形成自組裝單分子膜的特性來固定核酸基因[3-4]，形成的膜表面結構高度有序，穩定性好，有利于雜交檢測，并獲得環境目標樣品中的相關生物信息。

目前，利用白腐菌對木質素進行生物降解已成為環境領域的研究熱點，黃孢原毛平革菌是白腐菌中的代表菌株，具有較強的降解木質素能力。它所產生的木素過氧化物酶在木質素的分解中起著關鍵作用[5-6]，對其編碼基因的快速準確檢測有利于深入了解降解過程。用于雜交識別的自組裝基因膜修飾電極電化學檢測方法可實現對木素過氧化物編碼基因的快速檢測，操作簡便，具有較好的應用前景。

本文作者利用巰基和金電極之間的化學鍵作用，將巰基修飾的單鏈基因探針自組裝于金電極表面制備了捕獲探針修飾金電極；將黃孢原毛平革菌木素過氧化物酶編碼基因作為檢測的目標基因，使用生物素標記信號探針，兩者競爭與捕獲探針雜交。采用了差分脈沖伏安法、循環伏安法、交流阻抗法和電流—時間曲線法等一系列電化學分析方法[7-8]，通過自組裝時間和信號探針最佳響應濃度的優化，目標基因的線性檢測范圍的確定，以及修飾電極的再生性能研究，最終建立了該自組裝基因分子膜修飾金電極用于檢測黃孢原毛平革菌木素過氧化物酶編碼基因的分析方法，以期用于木質素生物降解過程中基因的快速痕量檢測。

1 實驗

1.1 實驗儀器

CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)，其三電極系統如下：d0.5 mm的自制金電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為對電極。

1.2 實驗材料

磷酸緩沖溶液 PB(Na2HPO4，1/15 mol/L；KH2PO4，1/15 mol/L；pH=6.98及7.38)。DNA雜交液：2×SSC緩沖溶液(0.3 mol/L NaCl，0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O，pH=8.0)。電極浸洗液：Tris-Cl緩沖溶液(0.1 mol/L三羥基氨基甲烷(Tris)，0.1 mol/L HCl，pH=8.0)。Piranha溶液：V(98% H2SO4):V(30% H2O2)=3:1(體積比)；0.5 mol/L H2SO4溶液；5 mmol/L Fe(CN)63-/Fe(CN)64-(鐵氰化鉀溶液)，0.1 mol/L KCl溶液，1 mmol/L巰基己醇(MCH)，1 mmol/L對苯二酚，0.5 mmol/L H2O2。所有試劑均為分析純或優級純試劑，所有溶液均用超純水配制。HRP-SA溶液由PB(pH=6.98)稀釋配制。

本研究所用低聚核苷酸序列為自行設計[9]，采用Clustal X對NCBI Gene Bank中黃孢原毛平格菌的10個lip序列進行了比對，然后用Primer Premier 5.0設計了捕獲探針、目標基因和信號探針，由上海生工生物技術有限公司合成。捕獲探針S1(5’→3’：HS-(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA)含有 20個堿基，5’端 用(CH2)6-SH 修 飾 。 信 號 探 針 S2(5’→3’：TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-Biotin)和目標基因S3(5’→3’： TGGCAGTCCTTCGTCAACAA)也含有 20個堿基，均能和捕獲探針互補雜交，前者5’端用生物素修飾。辣根過氧化物酶標記鏈親和素(HRP-SA)購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金電極的制備

采用自制金電極(d0.5 mm)作為工作電極[10]。截取長度為1.5 cm的d0.5 mm金絲(純度＞99.99%)，在其末端纏繞10 cm長的銅絲。截取長度為5 cm、內徑為2 mm的干燥潔凈熱熔玻璃管，將其一端置于酒精噴燈火焰的外焰上灼燒，當尖端玻璃在高溫下熔融呈水滴狀時，迅速將末端纏繞有銅絲的金絲插入其中，使熔融態的玻璃包裹住金絲。灼燒過程中需不斷轉動玻璃管使其受熱均勻，確保金絲和玻璃間不會形成氣泡。灼燒完成后，離開火焰的瞬間，迅速將灼燒過的玻璃管倒置，熔融態的玻璃因重力作用緩慢向下流并冷卻，保證金絲被玻璃緊密包裹。將初步制成的電極在 0～6號金相紗紙上依次畫圈打磨，直至裸露的金盤與外裹的玻璃同一平面，表面光亮無劃痕。將所制金電極浸入水中數小時，觀察玻璃管內壁是否潮濕，考察其是否漏水，同時用萬能表檢測導電性。制得的電極既不漏水又具有良好的導電性，用A-B膠將玻璃管后端封閉，以固定銅絲并防止后續實驗管內滲水。

1.3.2 金電極的預處理

用0.5 μm Al2O3糊進行拋光至電極表面光潔；將電極浸入Piranha溶液中浸泡3 h，以去除電極上的雜質；以0.5 mol/L H2SO4溶液為底液，在-0.8～1.0 V范圍內，以100 mV/s的掃描速度進行循環伏安法(CV)掃描，電化學處理直至電流達到穩態。電化學處理完畢后，以鐵氰化鉀溶液(5 mmol/L Fe(CN)63-+0.1 mol/L KCl)為底液進行循環伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)掃描。

1.3.3 捕獲探針S1在金電極上的自組裝

滴取4 μL 14.7 μmol/L的巰基修飾捕獲探針S1溶液 (HS-ssDNA)到金電極表面[11]。于4 ℃通過巰基-金化學鍵作用自組裝成膜，每隔1 h取出，依次用Tris緩沖溶液、超純水浸洗電極表面以除去非特異性吸附，以鐵氰化鉀溶液(5 mmol/L Fe(CN)63-+0.1 mol/L KCl)為底液進行差分脈沖伏安法(DPV)掃描，優化自組裝時間，制備巰基自組裝基因分子膜修飾金電極(HS-ssDNA/Au電極)。

1.3.4 信號探針S2最佳響應濃度的優化

二是優化預算執行流程。省業務主管部門按規定時限制定轉移支付資金分配方案，將部門代編預算分解到基層預算單位。省財政部門全面推進國庫集中支付電子化管理，改進政府采購流程，精簡基建項目財政資金撥付程序。

實驗過程如圖1所示。將制備好的HS-ssDNA/Au電極浸入400 μL的1 mmol/L巰基己醇(MCH)中，于室溫下封閉1 h[11]；用Tris緩沖溶液、超純水浸洗后，浸入400 μL信號探針S2檢測液中，于37 ℃雜交1 h，制得雙鏈 DNA修飾金電極(HS-dsDNA/Au)；用 Tris緩沖溶液、超純水浸洗電極；將 HS-dsDNA/Au浸入400 μL稀釋度為1:500(HRP-SA:PB(pH=6.98)的體積比)的辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-SA)溶液中，于37℃培育30 min，運用生物素和鏈親和素之間的特異性作用將HRP標記在基因鏈上。在S1、HRP-SA濃度固定的條件下，改變S2的濃度，以含有1 mmol/L對苯二酚的的磷酸緩沖溶液 PB(pH=7.38)為底液，在-0.4～0.6 V范圍內進行循環伏安法(CV)掃描，尋找對苯二酚的最佳還原電位。在最佳還原電位下，在含0.5 mmol/L H2O2底液中采用電流—時間曲線法(i—t)記錄電流躍遷值，優化S2最佳響應濃度。

1.3.5 目標基因S3檢測

實驗過程如圖1所示。將制備好的HS-ssDNA/Au電極浸入400 μL的1 mmol/L巰基己醇(MCH)中，于室溫下封閉1 h；用Tris緩沖溶液、超純水浸洗后，浸入400 μL含0.51 μmol/L信號探針S2及不同濃度的目標基因S3混合檢測液中，于37 ℃雜交1 h，在S2濃度保持為 0.51 μmol/L時的最佳響應值情況下，讓S3與S2競爭與 S1雜交，然后進行封閉和酶標記，檢測過程同步驟1.3.4。根據不同濃度目標基因的電流躍遷值，測定工作曲線。

1.3.6 自組裝膜修飾金電極的再生

將雜交檢測后的金電極浸在 80 ℃的熱水中 3 min，使雜交產物解鏈，然后迅速浸入 0 ℃的冰水中浸泡30 s，使解鏈后信號探針和目標基因脫落，而捕獲探針仍通過S—Au鍵固定在金表面，自組裝膜修飾金電極實現再生為后續實驗循環所用。此過程用交流阻抗法(EIS)表征。

2 結果與討論

2.1 自組裝時間與響應信號的關系

巰基化合物在Au表面的自組裝動力學分為兩步:首先是快速的吸附過程，在幾分鐘內完成，厚度達極限值的80%～90%；第二步為較慢的表面重組過程，一般持續數小時，厚度逐漸達到極限值，表面結構高度有序，穩定性好[12-14]。

如圖 2所示，隨著自組裝時間的增加，HS-ssDNA/Au的差分脈沖伏安法(DPV)還原峰電流不斷降低，說明不斷有HS-ssDNA吸附于金表面并完成自組裝基因分子層[15]。當自組裝時間大于15 h，電流趨于穩定。將自組裝固定15 h后的HS-ssDNA/Au于4 ℃保存一周后再檢測，電流基本沒有衰減，響應信號比較穩定，說明形成穩定的、完整有序的分子層。故選擇最優自組裝時間為15 h。

圖1 自組裝膜修飾金電極電化學競爭式雜交檢測DNA原理示意圖Fig. 1 Illustration of hybridization and competitive detection procedure by self-assembled monolayer of gold electrode

圖2 不同自組裝時間條件下的HS-ssDNA/Au電極的差分脈沖伏安曲線Fig. 2 DPV curves of HS-ssDNA/Au in 0.1 mol/L KCl solution containing 5.0 mmol/L ferricyanide at different self-assembled times

2.2 信號探針S2最佳響應濃度

恰當的信號探針量S2才能反應準確的檢測信號。當S2量不足時，部分捕獲探針S1未能與S2雜交，在后續測定目標基因時，此部分S2與無信號標記的目標基因 S3雜交，導致此部分雜交信號不被檢出；當 S2量過飽和時，過飽和部分的 S2與 S3競爭雜交的信號同樣未能被準確反映。兩者均影響競爭雜交檢測的靈敏性。因此必須優化S2的最佳響應濃度。如圖3所示，當S2的濃度在0.07～0. 51 μmol/L之間時，電流—時間曲線法(i—t)[16]的電流躍遷值不斷快速攀升，相對于金表面固定的S1而言，此階段S2的量仍然不足；當S2濃度大于0.51 μmol/L時，電流躍遷值逐漸趨于穩定，此階段 S1和 S2的量恰好完全雜交，處于動態平衡。因此，本文作者以0.51 μmol/L作為信號探針S2的最佳響應濃度。

圖3 不同S2濃度下電流—時間曲線法的電流躍遷值Fig. 3 Electrical current response in current—time curve to detection probe under different concentration

2.3 金電極雜交檢測的電化學表征

2.4 修飾電極的線性檢測范圍

電流—時間曲線法表征線性檢測工作曲線[16]。在S2濃度保持為0.51 μmol/L的情況下，讓S3與S2競爭與修飾電極上的 S1雜交。S3與 S2具有相同的核苷酸序列，都能與捕獲探針完全雜交。由于S2的3’端連接生物素，能通過生物素和親和素之間的特異性結合與辣根過氧化物酶標記鏈親和素(HRP-SA)相連，而 S2的3’端未連接生物素則不能通過上述作用標記上辣根過氧化物酶(HRP)。通過S2與S1雜交作用留在修飾電極上的HRP保持了較高的酶催化活性，檢測底液中的對苯二酚能夠有效地在酶與電極之間轉移電子。對苯二酚為HRP的電子媒介，在HRP催化下H2O2將對苯二酚氧化成苯醌，加入H2O2后產生明顯的還原電流躍遷響應值[3]。由于HRP催化產物產生的還原電流與酶的量成正比，進而與修飾電極表面HRP標記的S2量成正比。因此在一定的濃度范圍內，隨著S3濃度的增加，通過堿基相互作用雜交結合在修飾電極上的 S3量增多，因此與 S1結合的 S2量相應減少，即辣根過氧化物酶標記量也相應減少，因此電流躍遷值隨目標基因S3濃度增大而減小，如圖4所示。

以目標基因濃度為橫坐標，以電流躍遷響應值為縱坐標，繪出修飾金電極檢測黃孢原毛平革菌木素過氧化物酶編碼基因的低濃度段工作曲線，如圖5所示。其線性檢測范圍為 7.51×10-12～1.05×10-9mol/L，線性回歸線方程為y=-143.98x+0.252 2，其中y代表電流躍遷值(μA)，x代表 S7的濃度(μmol/L)；可決系數R2=0.996 4，誤差線來源于3次重復平行實驗。結果表明，S3與S2存在競爭關系，S3濃度越高，S2與修飾電極上的S1雜交結合越少，辣根過氧化物酶在修飾電極上的標記量就越少，因此電流躍遷響應值越小。檢出下限是7.51×10-13mol/L。

圖4 不同S3濃度下的電流—時間曲線(i—t)Fig. 4 Current—time curve of target nucleic acid under different concentrations and detection probe (0.51 μmol/L) at 37 ℃ for 1 h, using PBS (pH 7.38) containing 0.5 mmol/L H2O2 and 1 mmol/L hydroquinone

圖5 目標基因檢測工作曲線Fig. 5 Calibration curve of current response to target DNA under optimal experimental conditions

2.5 自組裝膜修飾金電極的再生性能

根據交流阻抗圖原理分析[17-18]，如圖6所示，捕獲探針S1能有效識別溶液中的互補序列S2和S3，雜交生成的 dsDNA增加了修飾電極表面荷負電量，同時電極表面修飾層的結構變得更為稠密，進一步阻礙了[Fe(CN)6]4-/3-與電極表面電子交換，因此電極阻抗不斷增大。這種界面阻抗增加是核酸功能化電極的特性。再生處理后的自組裝膜修飾金電極電阻跟封閉后的原修飾電極電阻相差無幾。在同樣的實驗條件下，將其繼續用于新一輪雜交實驗后的阻抗也與上一輪雜交后的阻抗相差不大，說明經過再生處理，原有的雜交鏈已解開脫落而捕獲探針S1仍固定于金電極表面，仍能循環利用于雜交檢測，由此可得，該修飾電極具有良好的再生性能。

圖6 修飾電極再生前后交流阻抗對比圖Fig. 6 Electrochemical impedance spectra (Nyquist plots) of electrodes: (a) Bare gold electrode; (b) Gold electrode modified with CP (14.7 μmol/L) for 15 h and 1 mmol/L MCH; (c)Modified gold electrode with target nucleic acid (0.45 nmol/L)and DP (0.51 μmol/L) for 1 h at 37 ℃; (d) Regeneration of modified gold electrode after step (c); (e) Regenerated modified gold electrode used in hybridization under the same condition of step (c), using 0.1 mol/L KCl solution containing 5.0 mmol/L ferricyanide, with frequency range of 0.01-105 Hz,bias potential of +0.08 V and AC amplitude of 5 mV

3 結論

1) 巰基修飾的捕獲探針 S1在金電極表面自組裝15 h后形成穩定有序的分子膜，具有穩定的電化學性能。信號探針S2的濃度為0.51 μmol/L時，能與修飾金電極表面的S1達到飽和雜交的動態平衡，能準確反映黃孢原毛平革菌木素過氧化酶編碼基因的檢測信號，因此以S2濃度0.51 μmol/L為最佳響應濃度，確保競爭雜交檢測的靈敏性。

2) 在目標基因 S3濃度范圍為 7.51×10-12～1.05×10-9mol/L時，電化學響應信號隨S3濃度增大而減小，并形成線性關系。表明 S3與 S2形成競爭關系，S3濃度越高，S2與修飾電極上的S1雜交結合越少，辣根過氧化物酶在修飾電極上的標記量就越少，因此電化學信號越小，驗證了其具有競爭雜交檢測機制。

4) 再生處理后的修飾金電極電阻跟封閉后的原修飾電極電阻相差無幾，說明該電極再生性能良好。檢出下限為7.51×10-13mol/L可實現目標基因的低濃度檢測。基于該修飾金電極所建立的分析方法有望用于木質素生物降解過程中基因的快速痕量檢測。

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