近紅外雙色光譜成像技術在教學中的應用

黃國韋

（汕頭大學 醫學院病理學教研室，廣東 汕頭 515041）

隨著功能基因組學研究的不斷深入，蛋白研究變得越來越迫切和重要.近紅外雙色激光蛋白檢測技術，為國內蛋白功能研究者提供了極其重要的研究工具，其主要應用包括：WesternBlot檢測、In CellWestern檢測、EMSA和活體成像等.該技術利用近紅外激光低背景，高靈敏度的特點，對蛋白及磷酸化蛋白進行準確定量檢測；而且增加了蛋白定量的線性范圍.本文試就其定量原理、方法及應用作一介紹，對推動廣大從事基礎研究的學生，特別是研究生本身的科研水平具有重要作用.

1 近紅外雙色成像技術的原理[1-2]

LI-COR根據紅外熒光的這一特點開發出Odyssey紅外成像系統，獨特的采用2個紅外激光作為激發光源，以掃描成像方式對樣品進行檢測.樣品載體可以是膜、凝膠和微孔板.該系統配置的2個紅外激光激發光源，激發光波長分別為680nm和780nm，配置的2個高靈敏度光敏二極管可以分別檢測720nm和820nm的發射熒光，因而Odyssey可同時檢測兩種IRDyes染料的熒光信號.IRDyes染料的最大吸收值與Odyssey的兩個紅外激光器680nm和780nm激發波長相匹配，其發射光波長又與Odyssey的兩個光敏二極管檢測波長相匹配，與同時IRDye700和IRDye800的發射波長峰值相隔100nm，因此Odyssey可以給出最大的靈敏度和最小的信號交叉.

2 近紅外雙色成像技術應用范圍

Odyssey紅外激光成像技術可以使用于蛋白定量、信號轉導、激酶研究、轉錄調控和凋亡、藥物篩選等領域.

3 近紅外雙色成像技術的應用舉例

3.1 定量Western檢測

膜經一抗孵育，再經熒光標記抗體孵育后進行Odyssey掃描成像，由于熒光信號強度與蛋白豐度具有更好的線性相關性，具備靈敏度高、定量準確、雙色檢測的特點.如下圖所示：

圖1 近紅外雙色成像技術進行定量Western檢測

3.2 ERK磷酸化檢測

觀察EGF刺激后A431細胞中ERK1and ERK2(p44/42MAPkinases)的磷酸化情況,一抗分別是兔抗ERK抗體和小鼠抗磷酸化ERK抗體,二抗用抗兔的IRDye800標記的抗體(green),和抗鼠的Alexa680標記的抗體(red).結果如下圖所示：

圖2 ERK磷酸化檢測

3.3 EMSA實驗中的應用

EMSA(Electrophoretic Mobility ShiftAssay)凝膠遷移實驗是研究DNA與蛋白質或RNA與蛋白質相互作用的常用技術.該技術是基于DNA/蛋白質或RNA/蛋白質復合體在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理.當蛋白質與一條人工合成的特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白，一般為轉錄或調控因子.起初是用32P同位素標記寡核苷酸探針,但是由于同位素的放射性很強,而且半衰期為14天,從定購同位素到標記，做完試驗,必須14天完成,既不安全也不方便；地高辛標記探針的非放射EMSA實驗技術，其缺陷是標記的探針純化后靈敏度弱；紅外熒光技術的出現，可以解決EMSA實驗中的探針示蹤問題，還可以進行雙色標記，檢測競爭性結合.如下圖所示：

圖3 近紅外成像技術檢測T7RNP結合到T7啟動子序列

4 掌握近紅外成像技術的必要性

隨著醫學及生物學研究的飛速發展，越來越多的科研人員希望將分子及細胞生物學技術從傳統的體外研究延伸到活體動物體內，以直接監控活體生物體內的細胞活動和基因表達，有效地研究觀測轉基因動物生理過程，譬如活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發生發展過程等.活體動物體內光學成像分為生物發光和熒光兩種技術.生物發光是利用熒光素酶基因標記目的核酸和細胞，在ATP和氧氣存在時，通過熒光素酶催化注射進體內的底物熒光素，實現發光過程.熒光技術則是采用熒光素或熒光素基因標記多肽、抗體、小分子藥物，在外界光源的激發下產生熒光.而傳統熒光技術作為臨床研究潛在的有力工具，自身的生物發光信號遠弱于熒光信號，而且光在體內的傳播會被散播和吸收，需要高靈敏度的檢測儀器，成本非常昂貴.同時，發光幾乎都是酶-底物類型的反應，需要涉及不同種類轉基因細胞株或轉基因動物模型，復雜程度較高，所以和熒光技術相比，更容易受反應體系中的成分影響.傳統熒光由于自發熒光干擾、光的組織吸收、靈敏度較低的特點阻礙了在活體動物體內成像的應用.近紅外光譜由于良好的組織滲透性、無毒性和放射性等特點，可以真正無損傷地研究各項生理指標，數據結果真實可靠.

因此，廣大科研工作者應該掌握近紅外成像技術，在科研工作中加以廣泛的應用，必將大力推動基礎科研工作的發展.

〔1〕Philip R.Christensen, Bruce M.Jakosky,Hugh H.Kieffer，et al.The thermal emission imaging system (Themis)for the Mars 2001 Odyssey mission.USA: Mars Odyssey[J].2004,110(3):85-130.

〔2〕Suresh T.Mathews,Eric P.Plaisance,Teayoun Kim.Imaging systems for westerns:chemiluminescence versus infrared detection.Methods in Molecular Biology.2009,536(5):499-513.