動物源性多重耐藥大腸桿菌的分離與鑒定

隋 慧，楊金生

（1．遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧 錦州121001；2．吉林省畜牧獸醫科學研究院，吉林 長春130062）

近幾年來，大腸桿菌病給畜牧業造成的經濟損失日趨嚴重，致病性大腸桿菌已經成為醫學和動物醫學臨床感染中最常見的病原菌之一。臨床上主要表現為臍炎、關節炎、腹膜炎、輸卵管炎、眼球炎、敗血癥。每年死亡的幼豬中約有50%與產毒性大腸桿菌有關［1］，20世紀40年代以來，隨著百余種抗菌藥物的廣泛使用，細菌對抗菌藥物耐藥已成為當今時代的一個特征。本試驗對從遼寧省5個地區分離出的64株動物源性大腸桿菌進行了12種抗菌藥物的耐藥性監測與分析，從中選擇多重耐藥大腸桿菌7株供進一步研究用。

1 材料與方法

1．1 材料 普通營養肉湯、普通營養瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、半固體營養瓊脂，均按常規方法自行配制。糖微量發酵管，由杭州天和微生物試劑有限公司提供。革蘭染色試劑自配。藥敏紙片：氧氟沙星（OFL）、慶大霉素（GM）、鏈霉素（S）、氨芐青霉素（AM）、四環素（TE）、復方新諾明（SXT）、環丙沙星（CIP）、妥布霉素（TM）、壯觀霉素（SPT）、磺胺甲基異口惡唑（SMX）、氟哌酸（NOR）、頭孢氨芐（CX），購自衛生部抗菌藥物細菌耐藥性監測中心。

菌株：大腸桿菌ATCC25922：為大腸桿菌質控標準株，購自白求恩醫科大學細菌室；H10407：敏感性大腸桿菌，由吉林大學惠贈。病原性大腸桿菌：經過上述鑒定出的于2010年8月至2012年5月從沈陽、錦州、葫蘆島、阜新、撫順地區共分離出64株動物病原性大腸桿菌。

氯霉素：購自中國獸醫藥品監察所，含量為99．5%，批號：890322。硫酸慶大霉素：煙臺第二制藥廠生產，干品607μ／mg，批號：990527。諾氟沙星：浙江新昌制藥股份有限公司，含量為99．17%，批號：20000306。恩諾沙星：新昌原料藥廠生產純度為97．94%，批號：20000105。阿莫西林：為河北制藥（集團）有限公司，含量為99．36%，批號：990426。強力霉素：購自中國獸醫藥品監察所，含量為99．7%，批號：990319。

1．2 方法

1．2．1 病原性大腸桿菌的分離與鑒定 無菌操作將患有典型大腸桿菌病癥狀患畜的心、肝、血等病料或以無菌棉拭子從直腸中采樣，接種伊紅美藍、麥康凱瓊脂培養基上，37℃培養過夜，挑取單個典型菌落接種普通瓊脂培養基和普通肉湯培養基，進一步做三糖鐵試驗，選擇反應模式符合大腸桿菌特征的三糖鐵斜面進行涂片、染色、鏡檢。將疑為大腸桿菌的菌落進行斜面劃線，冷藏保存，以備進行生化鑒定和體外抑菌試驗。

將符合三糖鐵斜面反應模式的細菌染色鏡檢為革蘭陰性、兩端鈍圓、大多數單在的無芽孢短桿菌，進一步進行生化反應鑒定，將能夠發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖均產酸產氣，靛基質試驗、甲基紅試驗陽性，V－P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗為陰性者鑒定為大腸桿菌。

1．2．2 多重耐藥大腸桿菌的篩選 取鑒定后的純培養物接種于4mL的營養肉湯中，37℃培養16h后，取一定量的菌液，按常規方法進行菌液的活菌計數，剩余菌液在4℃保存。

采用藥敏紙片法按世界衛生組織（WHO）推薦的Kirby－Bauer氏法進行。將純培養菌制成懸液，稀釋后菌液濃度為麥氏管的0．5號管（菌液濃度為106～107CFU／mL），均勻涂布0．1mL稀釋后菌液的營養瓊脂平板上中間鋪放好藥敏紙片，37℃培養16h，測定抑菌環直徑，每次設藥敏質控株ATCC25922為對照菌，根據上述標準判定大腸桿菌是否對抗菌藥物耐藥，從中挑選出多重耐藥大腸桿菌供進一步研究用。

采用平皿二倍稀釋法測定各菌株對上述6種藥品的最低抑菌濃度（MIC），結果按美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）的標準判斷。

2 結果

2．1 鏡檢與生化鑒定結果 于2010年8月至2012年5月從沈陽、錦州、葫蘆島、阜新、撫順地區共分離出64株動物源性大腸桿菌，其中，禽大腸桿菌28株，豬大腸桿菌31株，犬大腸桿菌4株，狐貍大腸桿菌1株。

2．2 64株大腸桿菌的耐藥譜 從遼寧省5個地區分離出大腸桿菌64株，經對12種抗菌藥物的耐藥性普查結果表明（圖1）：64株受檢菌株全部對一種或多種抗菌藥物有耐藥性，無一全部敏感株。單耐藥株占1．56%（1／64），2～4耐藥株占9．38%（6／64），5～7耐藥株占15．63%（10／64），8～10耐藥株占12．5%（8／64）。64株大腸桿菌中，共有30種以上的耐藥譜型，大多數為多重耐藥株，最普遍的耐藥類型是：TE，SXT，SMX、S、AM、CIP、NOR、OFL、GM，它們占受檢菌株的50%。

2．3 64株大腸桿菌藥敏試驗結果 12種抗菌藥物中，抑菌作用最強的是CX，敏感菌株占81．25%、SPT（78．13%）、TM（67．19%）；而 SMX、SXT、TE等藥物則表現出很高的耐藥性，耐藥菌株分別占SMX（89．06%）、TE（87．5%）、SXT（84．38%）、CB（78．13%）、S（70．31%），此 外，OFL（65．63%）、NOR（62．5%）、CIP（59．38%）、GM（50%）的耐藥株已十分普遍（見表1）。

2．4 隨機挑選20株大腸桿菌對6種抗菌藥物的最低抑菌濃度測定的結果 臨床分離動物源性大腸桿菌對6種抗菌藥物的耐藥程度十分嚴重。對硫酸慶大霉素，最低抑菌濃度為敏感株的10倍以上耐藥株已占58．5%；對氯霉素、氟哌酸、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素最低抑菌濃度為敏感株的數十倍的耐藥株分別占32．5%、45．5%、56．5%、62．5%、60．5% 。

圖1 64株動物源性大腸桿菌耐藥譜

表1 64株動物源性大腸桿菌藥敏試驗

2．5 多重耐藥株的篩選 選擇多重耐藥大腸桿菌7株，供進一步研究用。選擇的多重耐藥株對上述6種藥物的最小抑菌濃度（MIC）見表2。其中1號菌為H10407敏感株，9號菌為藥敏質控株，2，3，號菌為豬源性大腸桿菌4，5，6號菌為雞源性大腸桿菌，7號菌為犬源性大腸桿菌，8號菌為狐貍源性大腸桿菌。

3 討論

采用kirby－Bauer法，同時以質控標準菌株做對照，從遼寧省5個地區分離的64株大腸桿菌所做的對12種抗菌藥物的藥敏試驗結果表明，64株大腸桿菌均表現出不同程度的耐藥，在這些耐藥株中，單耐藥株為1株，6耐、7耐、10耐菌株居多，分別為5．87%、7．98%、5．88%，說明動物源性大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為主，不再停留在對同一類中數種抗菌藥物的交叉耐藥。對隨機抽取的20株動物源性大腸桿菌對6種抗菌藥物的最低抑菌濃度測定的結果表明，耐藥程度已經相當嚴重。臨床分離的大腸桿菌對硫酸慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素的最低抑菌濃度為敏感株數10倍以上的菌株已超過半數。

表2 7株動物源性大腸桿菌對6種抗菌藥物最低抑菌濃度 （MICμg／mL）值

多重耐藥株的大量出現，可能與耐藥性質粒［2］、菌體細胞膜通透性，菌體上存在的主動外排系統有關［3－5］。菌體細胞膜通透性的改變僅能引起低程度的耐藥，多重耐藥主要與存在于膜上的主動外排系統有關，菌體細胞膜通透性的改變與主動外排系統的超量表達共同作用可引起細菌對多種抗菌藥物高頻率高水平耐藥，耐藥性質粒的存在可使多重耐藥水平提高數倍。大腸桿菌膜上存在Ecr、EmrE、EmrAB、EmrD、QacE、AcrAB、AcrEF等主動外排系統。其中染色體DNA上的AcrAB基因編碼的AcrAB蛋白是最主要的主動外排系統，可完成多種藥物的外輸，如果使該系統失活，則菌株即從多重耐藥狀態變為相對敏感狀態。多重耐藥性的產生是由于外輸泵轉錄增加或相應的mRNA穩定性增加所致。AcrAB基因的轉錄水平增加相應的mRNA穩定性增加引起的多重耐藥程度和范圍尚待進一步研究。

臨床應用較多的慶大霉素、鏈霉素、復方新諾明、氟哌酸等的耐藥株已顯著增加，只有極少使用的頭孢氨芐對大腸桿菌的抑制作用強，因而，應盡量避免使用臨床應用較多的藥物，一方面影響臨床治療效果，另一方面促進耐藥因素的擴散。

［1］ 王晶鈺，于艷榮，張彥明，等．雞源大腸桿菌某些生物學特性與致病力相關特性的研究［J］．中國家禽，1999，11（6）：5－10．

［2］ 趙靜，楊漢春，查振林．規?；i場大腸桿菌耐藥性監測 ［J］．中國獸醫雜志，1998，24（11）：12－13．

［3］ 張小林，李家泰．主動外排系統在大腸桿菌中的分布與表達［J］．中國臨床藥理學雜志，1999，15（3）：171－174．

［4］ Martin J，Everett，Yu Fang Jin，etal．J V Piddock Conrtribution of Individual Mechanisms to Fluoroquinolone Resistance in 36Escherichia coli Strains Isolatated from Humans and Animals［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40：2380－2385．

［5］ John D，Goldman，David G，etal．Multiple Antibiotic Resisrance（mar）Locus Protects Escherichia coli from Rapid Cell Killing by Fluoroquinolones［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996．40：1266－1268．