1株藏豬源鼠傷寒沙門菌的分離與鑒定

貢 嘎，查 果，拉 珍，索朗斯珠

（西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝860000）

豬沙門菌在自然界中十分普遍，是由豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等引起仔豬的一種傳染病。本病一年四季均可發生，但以多雨潮濕季節發病較多，多與其他病毒，如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒混合感染，混合感染時導致發病率與死亡率增高［1－3］。

2012年6月份，西藏地區某藏豬養殖場的豬體溫突然升高，隨后呼吸困難，耳根、腹下皮膚有紅色斑點等癥狀。病死豬剖檢可見脾臟顯著腫大、出血，肝、腎有不同程度的腫大、充血、出血，肺臟整個呈干酪樣等病變。

1 材料與方法

1．1 病料 西藏地區某藏豬養殖場病死豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結。

1．2 試驗動物 上海斯萊克實驗動物有限公司購買10只SPF級4周齡Balb／C小鼠，雌雄各半。

1．3 主要試劑 普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血平板、普通肉湯、三糖鐵斜面及各生化培養基均由本實驗室制備［4］。

細菌基因組DNA快速提取試劑盒，多功能DNA純化回收試劑盒，購自美國Omega公司；2×powerTaqPCR MasterMix，購自上海東勝有限公司；感受態大腸桿菌DH5α，購自北京全式金生物技術有限公司；克隆載體pMD18－T，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1．4 細菌的分離與鑒定 無菌采取病死藏豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結做為病料涂片，革蘭染色鏡檢。

無菌采集自然病死藏豬的心血、肝、脾、肺、腎、淋巴結分別接種普通平板、血平板、麥康凱瓊脂平板，分別37℃培養24h，從中分離到1株疑似沙門菌的革蘭陰性直桿菌。取單個菌落進行純培養，同時進行涂片染色鏡檢。

取分離菌株的純培養物接種生化培養基，設對照組。將試驗管與對照管同時置37℃培養，觀察結果。

PCR鑒定：引物設計根據沙門菌argT基因保守序列設計一套引物，序列如下：S1：5′－ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG－3′；S2：5′－TGTTGTCCT GCCCCTGGTAAGAGA－3′，擴增目的片段為495bp。

細菌DNA提取與PCR：提取DNA嚴格按試劑盒說明書進行。采用普通PCR擴增。陽性條帶割膠，經純化后連入pMD18－T載體，克隆測序。

PCR擴增條件為：95℃預變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸7min，4℃保存。

1．5 動物致病性試驗 試驗組用18h肉湯培養物給小鼠灌胃，0．2mL／只；對照組用普通肉湯0．2 mL／只給小鼠灌胃。

1．6 藥物敏感性試驗 用滅菌涂棒將普通肉湯培養物均勻致密地涂布于普通瓊脂平板，將藥敏紙片貼壓于平板上，37℃培養24h，觀察結果。

2 結果

2．1 鏡檢及分離培養 鏡檢可見1株革蘭陰性直桿菌、有鞭毛，能運動，無芽孢及莢膜；在普通平板上生長菌落細小、圓形、凸起、光滑、邊緣整齊；在麥康凱瓊脂平皿上，菌落細小、邊緣整齊、光滑凸起；在血平板上生長大菌落、凸起、暗白色、不溶血、邊緣整齊。

2．2 生化結果 見表1。

表1 生化鑒定

2．3 PCR鑒定 在生化鑒定的基礎上，分離菌PCR擴增，擴增產物在含1%瓊脂糖凝膠電泳，結果可以見到1條清晰的目的條帶，大小與預期結果相符。擴增產物的測序結果在GenBank上進行序列分析比對，結果與鼠傷寒沙門菌的基因序列同源性達到100%，確定為鼠傷寒沙門菌（見圖1）。

2．4 動物致病性試驗 4周齡Balb／C小鼠隨機分2組，每組5只，試驗組小鼠灌胃菌液后的8h后發病，精神委靡、食欲下降或不食，18h開始出現死亡。剖檢觀察，可見脾臟顯著腫大，肝臟出血，有小壞死點，肺臟有出血點、變脆，腎臟腫大。從死亡小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中均能分離出與感染細菌相似的細菌，經PCR鑒定與所分離出的菌一致。對照組小鼠仍存活。

圖1 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2．5 藥物敏感性試驗 該菌株對臨床常用藥物如鏈霉素、四環素、青霉素、壯觀霉素、慶大霉素、萬古霉素均無作用，對紅霉素、頭孢拉定低度敏感；對環丙沙星和復方新諾明高度敏感。

3 討論

本試驗從西藏地區某藏豬養殖基地病死藏豬體內分離到1株革蘭陰性直桿菌，經生化及PCR鑒定為豬鼠傷寒沙門菌。

胡新崗等報道［5］，試驗小鼠接種分離的鼠傷寒沙門菌培養物后24h內出現死亡，這與本次小鼠菌液灌胃后的8h后發病，18h開始出現死亡均一致。

本次分離的菌株耐藥性較強。藥敏試驗的10種常用抗生素中大部分都對該菌株不敏感，對紅霉素、頭孢拉定低度敏感，只對環丙沙星和復方新諾明高度敏感。可見藏豬對沙門菌的耐藥性較嚴重，這可能藏區飼養藏豬過程中大量使用或濫用抗生素的后果，提醒飼養人員今后在使用抗生素等藥物時慎重選擇。

［1］ 湯景元，姜平，鄧雨修，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒和致病性沙門菌的混合感染［J］．中國獸醫學報，2005，25（4）：337－338．

［2］ 林進秋，李沐華．豬圓環病毒2型和致病性沙門菌的混合感染［J］．廣東畜牧獸醫科技，2005，30（6）：33－34．

［3］ 侯洪烈．豬沙門菌和豬瘟混合感染的診治［J］．畜牧與獸醫，2002，34（10）：23－24．

［4］ 姚火春．獸醫微生物學實驗指導［M］．北京：中國農業出版社，2011：36－42．

［5］ 胡新崗，黃銀云，郭廣富，等．豬鼠傷寒沙門菌的分離與鑒定［J］．畜牧與獸醫，2005，37（11）：44－45．