豬冷凍精液應激溫度優化的試驗

張雪峰，張守亮，張 良，李 智，宋永利，尹柏雙，付連軍

（吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林132101）

中國豬冷凍精液研究始于20世紀70年代，在隨后的20多年里，豬冷凍精液取得很大的進步，技術也愈加成熟。但是由于多種因素影響，在中國對地方豬種資源進行活體保種困難較大，這就要求尋求更加有效的保種方式，精液冷凍保存技術為此提供了有效途徑。現有的精液冷凍保護技術只有部分精子能夠經受住冷凍，通過升溫恢復原有部分活性。在冷凍過程中，溶液生成冰晶對精子產生的機械性損傷及由于滲透壓改變引起的溶液性損傷是削弱精子凍后生理活性的重要原因［1－4］，故對冷凍過程中冰晶生成機理等進行深入地研究也是精液冷凍領域內研究的一個重要內容。Polge等［5］發現了甘油在冷凍過程中的保護作用，使精液冷凍獲得了成功，提出了微晶學說。當精液溫度從體溫降低到接近于冰點或從低溫恢復到體溫的過程，對精子具有非常嚴重的影響，精子活率會受到溫度的反復變化造成不可逆的下降［6］。

冷凍過程中精子細胞不但要對保存溫度（－196℃）有耐受能力，而且要能經受從射精時的集體溫度到保存時超低溫的變化而活力不會過度降低。因此，溫度的控制就成了精液冷凍取得成功的關鍵因素之一，在冷凍時要求精液溫度持續下降，不允許回升，不允許出現諸如二次結冰之類的溫度回升現象，并在精液冷凍過程中，冷凍溫度要求快速通過有害溫區（0℃～60℃）。因此，本試驗研究了應激溫度對豬冷凍精液保存的影響研究。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及主要儀器 葡萄糖、乳糖、檸檬酸鈉、甘氨酸、卵黃實驗室提供；RBL－PA－Ⅱ型胚胎程序冷凍儀，北京若比鄰電子信息技術有限責任公司生產。

1．2 方法

1．2．1 樣品采集 精液采集于吉林農業科技學院種豬場，選擇成年、體質健康、性欲旺盛、采精頻率正常的種公豬，收集精液中段富含精子部分，經4層滅菌紗布過濾，在37℃左右保溫瓶中運回實驗室，在生物顯微鏡下進行精液品質常規檢查，選擇活率0．7以上，密度“中”級以上的精液用于試驗。

1．2．2 精液的前處理 將采集的精液保存在保溫瓶中（32℃～37℃）靜置60min，為了防止長時間靜置使精子進入假死狀態，在靜置0．5h后需輕輕晃動貯精保溫瓶，使精子恢復活力，然后離心，棄掉絕大部分精清，保留約占離心后濃縮段精液量二分之一的精清。

1．2．3 稀釋液的配制 用電子天平準確稱量各種試劑，用注射器吸取一定體積的卵黃，按比例用雙蒸水溶解，搖勻，盛入編號試劑瓶中，配制成稀釋液基礎液，過濾后高壓滅菌，待冷卻至室溫放入5℃冰箱中備用。采精前，取出基礎液按比例加入卵黃配制成稀釋Ⅰ液（葡萄糖：22．0g／L；乳糖：30．0g／L；檸檬酸鈉：3．0g／L；甘氨酸：8．0g／L；卵黃：300mL／L）。置于37℃隔水電熱恒溫培養箱中預熱。向Ⅰ液加3%甘油即為Ⅱ液。

1．2．4 精液的稀釋與平衡 采用二次稀釋法進行稀釋。先將Ⅰ液按1∶1比例緩慢倒入離心后的精液中進行等溫稀釋（32℃～35℃），用16層紗布包裹離心管，連同Ⅱ液一起放入5℃冰箱中平衡2h再加入占第一次稀釋后精液總量二分之一的Ⅱ液，繼續平衡2h，保持精液最終稀釋比例為1∶2。

1．2．5 精子活力檢測 只有直線前進的精子才是正常的運動形式，直線運動的精子數占總精子數的百分率稱為精子活力。精子活力檢查常采用目測法，用恒溫載物臺將精子加熱到35℃～37℃，在100～400倍顯微鏡下觀察精子的運動狀態，每個樣本觀察3個以上的視野。精子活力常用10級制，即0．1～1．0，一般低于0．4級的精子不宜用于輸精，許多種公豬站以精子活力為0．7～0．8作為篩選標準［7－9］。觀察3種方案冷凍前后精子活力。將待檢精子稀釋為1×107個／mL，取5μL稀釋精子滴于載玻片上，加蓋玻片后在相差顯微鏡下觀察、計數，至少計數200個精子，精子活力＝直線運動的精子數／計數精子總數。

1．2．6 精液冷凍 向經過稀釋與平衡的精液中加入與精液同溫的冷凍保護劑（甘油），設置濃度為3% ，將Ⅱ液和精液平衡2h后，用程序冷凍儀凍存，放入液氮本試驗使用3種方案冷凍精液（見表1～3），然后制作細管型凍精（為0．5mL）。

表1 冷凍方案1的降溫程序

表2 冷凍方案2的降溫程序

表3 冷凍方案3的降溫程序

2 結果

2．1 鮮精活力檢測 經過精子活力測定結果表明，鮮精精子活力為0．70±0．02，說明采集的鮮精精子存活率較高，可以做人工授精。

2．2 加入保護劑后精子活力檢測 加入保護劑平衡2h后，檢測精子活力為0．41±0．02，與鮮精相比，精子活力下降很大，加入保護劑甘油后，對精子的毒性較大，本試驗只加了3%甘油，但效果仍然不理想，保護劑的含量及保護劑的成分還需進一步研究，另外，精子的冷凍程序還需要進一步研究來優化精子的冷凍效果，探討更適合精子冷凍的方法。

2．3 解凍后3種方案精子活力檢測 3種方案冷凍精子后，在37℃、30s的條件解凍后精子活力為0．16±0．02、0．17±0．04、0．34±0．03，第3種方案相對較好，還有待于今后進一步來研究，來探討最佳的精子冷凍、解凍方案。使精子冷凍效果更佳。

3 討論

迄今為止，國際上己經召開了5次關于豬精液冷凍保存的大型國際會議，研究者們在保存方法、精液冷凍處理程序等方面作了大量的工作，并對豬精液冷凍保存的發展起到了積極的推動作用。但是由于繁殖成績不理想，豬冷凍精液仍沒有得到大范圍推廣。以目前水平來看，豬冷凍精液的產仔率40%～70%，窩產仔數為7～10頭，分別比常規液態保存精液低20%～30%，少2～3頭。

到目前為止，由于冷凍精液人工授精后母豬受胎率較低，大多數地區采用豬冷凍精液進行人工授精的數量急劇下降。因此，必須解決豬冷凍精液的方法。

精子射出時經副性腺分泌的精漿稀釋，同時獲得運動能力。保存時稀釋精液能減弱精子運動、抑制代謝、延長體外存活時間、擴大精液體積并提高精液利用率。因此，稀釋液對冷凍效果也有影響。較低程度的稀釋促進精子運動，可能是沖淡了精漿中一些抑制代謝的物質。而過度稀釋導致精子喪失運動能力、代謝活性和受精能力，即稀釋效應［10］。高度稀釋的豬精子添加10%精漿后，存活率和頂體完整率均提高［11］。精漿中有維持精子運動和存活所必需的離子等，還有維持精子膜穩定和受精能力的蛋白質、抗氧化物質以及其他有益成分，過度稀釋使這些成分濃度過低，無法保護精子。過度稀釋帶來大量電解質，造成精子表面電荷過多，產生頭對頭凝集等有害反應。豬精漿中可能存在去獲能因子，在體外保存中可抑制精子獲能，而稀釋會使其濃度下降，使精子過早獲能，從而加速死亡［10］。精漿中也存在一些損害精子功能的物質，降低濃度或除去更利于精子保存，如精漿中的芳基磺胺酶能從對質膜有穩定作用的硫酸鹽復合糖上脫去硫酸鹽，并促進精子獲能［12］，多種因素影響精子冷凍效果，本試驗只是研究了應激溫度對豬精液冷凍的影響。

目前豬精液冷凍主要參照牛的精液冷凍，沒能針對豬精子特性提出一套適合豬精液的冷凍稀釋液、冷凍程序和方法。針對豬精子特性，建立一套有效的適合豬精液的冷凍方法是目前研究者們急需解決的方法。

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