1株貉源犬瘟熱病毒的分離鑒定

呂九云，張彥龍

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

犬瘟熱病毒（CDV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，是一種具有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，它能導(dǎo)致犬科、鼬科、浣熊科、大型貓科和淡水海豹等發(fā)病，以高度致死性且不具有免疫保護(hù)為感染性特點［1－2］。對于毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)來說，犬瘟熱一直沒有得到很好的控制，它常導(dǎo)致60%～100%的死亡率，對發(fā)病地區(qū)毛皮動物產(chǎn)業(yè)造成了近乎毀滅性的打擊，特別是近幾年，呈現(xiàn)了已免疫的毛皮動物種群仍然大規(guī)模發(fā)病的新流行特點［3］。烏蘇里貉在毛皮動物中對犬瘟熱最為敏感，很多用于預(yù)防犬、狐貍等動物的犬瘟熱疫苗不適合烏蘇里貉犬瘟熱的預(yù)防，研究適合

烏蘇里貉犬瘟熱防治的疫苗擺在我們面前。因此，具有較高免疫原性的貉源犬瘟熱弱毒對于貉子犬瘟熱的防治具有重要意義，本試驗另辟途徑，從未發(fā)病的貉子中分離毒株進(jìn)而為貉源犬瘟熱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌株、毒株及實驗動物 非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）本室保存；E．coliDH5α宿主菌，購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；試驗用烏蘇里貉，黑龍江省哈爾濱市周邊養(yǎng)殖場。

1．2 主要試劑和儀器 膠回收試劑盒，TaqDNA聚合酶，dNTP，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；隨機六聚體引物 （Random Primer）、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker DL－2 000、pMD18－T Vector，購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（GIBICOCat．No．12100－038），購自Invitrogen公司；胎牛血清（FBS）Gibco．Cat．No．10099－141；0．25%胰蛋白酶為本實驗室保存；0．22μm 微孔濾膜；TI－SM 倒置顯微鏡（Nikon E－clipse TS100）；MCO－18AIC （UV）CO2培 養(yǎng) 箱（SANYO Electric CO．Led made in JAPAN）；2700型PCR儀（美國 ABI公司）等儀器；CO2（99．99%），哈爾濱黎明氣體有限公司；ULTROSPEC 1100pro型紫分光光度計（GE Healthcare，美國）。

1．3 病毒的分離培養(yǎng)

1．3．1 分離病毒 自2006年至2009年，每年的11～12月份，將大量打皮期的烏蘇里貉的肺臟小心取出，剪去上部氣管，插入無菌注射器，灌注PBS，輕輕按摩肺臟，自氣管倒出收集，反復(fù)3次，離心收集細(xì)胞，加入適量DMEM后，肺臟巨噬細(xì)胞反復(fù)凍融3次，過濾除菌備用。

1．3．2 應(yīng)用ELISA篩選陽性樣本 巨噬細(xì)胞凍存液100μL，過夜包被在ELISA板上；次日3%牛血清白蛋白封閉1h，PBST洗滌3次，5min／次；加自制的狐血清的犬瘟熱多克隆抗體，室溫孵育1h，洗滌3～4次，5min／次；然后加鼠抗狐IgG單克隆抗體，室溫孵育1h，洗滌3～4次，5min／次；最后加兔抗鼠酶標(biāo)抗體，室溫孵育1h，洗滌5次，5min／次；加聯(lián)苯二胺顯色5min，加3NHCl終止反應(yīng)，目測陽性樣本。

1．3．3 病毒培養(yǎng) 在37℃下培養(yǎng)Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長3～4d后傳代培養(yǎng)，一般按1傳3或4傳代，同步接種樣本毒，在37℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞變化，并與正常作對照觀察。盲傳5代沒有病變的陰性丟棄，陽性樣本應(yīng)用RT－PCR鑒定。

1．3．4 蝕斑克隆分離單個毒株 在Vero細(xì)胞中同步接種分離的病毒，接毒10h后，加入血清含量為2%無酚紅DMEM營養(yǎng)瓊脂，第5天后，加入含中性紅的DMEM營養(yǎng)瓊脂染色，第6天，便形成蝕斑，挑取大小不同的蝕斑，克隆3次后選擇中等蝕斑克隆大小（0．5～0．8mm）的毒株。經(jīng)蝕斑克隆分離后，再繼代培養(yǎng)病毒，直到穩(wěn)定的細(xì)胞病變產(chǎn)生為止。

1．4 分離病毒RT－PCR鑒定

1．4．1 引物設(shè)計與合成 由犬瘟熱病毒F基因保守區(qū)設(shè)計1對引物進(jìn)行病毒鑒定，預(yù)期擴增的基因片段長度為324bp。F1：5′－ACTTGCAGGTGTAGCTTTAGG－3′；F2：5′－AATACGATCACGTAAACTCGG－3′。根據(jù) CDV Onderstepoort株 F基因序列，設(shè)計1對特異性引物，預(yù)期擴增的基因片段長度為1 053bp。F3：5′－GGG TACCTCCAACCTCAATGCTCAAG－3′；F4：5′－CGGATC CAGAGCGCCTAACCGTCTC－3′［5］。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．4．2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參照RNA提取試劑盒的說明提取總的RNA。總RNA 5μL，隨機六聚體引物1μL，70℃保溫10min后迅速在冰上急冷2min以上。上述模板6μL，5×M－MLV Buffer 2μL，dNTP Mixture（10mmol／L）0．5μL，RTase M－MLV（RNase H－）0．8μL，加 DEPC水至10μL。反轉(zhuǎn)錄條件42℃保溫1h，70℃保溫15min后冰上冷卻，得到cDNA溶液。

1．4．3 病毒cDNA的PCR擴增 總反應(yīng)體系25 μL：Taq（5U／μL）0．5μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，上下游引物各1μL，dNTP Mixture（2．5mmol／L）2．5μL，模板3μL，ddH2O 14．5μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃熱變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1．4．4 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在投射紫外燈下觀察并照相［6］。同時進(jìn)行膠回收，將PCR擴增片段克隆進(jìn)pMD18－T中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后送去上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1．5 病毒感染力（TCID50）測定 測定5、10、15代毒的TCID50，在1．5mL離心管中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10－1～10－10。將稀釋好的病毒接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μL。在每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，使細(xì)胞量達(dá)到2～3×105個／mL。設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排（100μL生長液＋100 μL細(xì)胞懸液）。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察3～5d。

1．6 血清中和試驗 取該毒株細(xì)胞培養(yǎng)物5mL，加入CDV陽性血清1．2mL，混勻．置37℃感作1 h，取感作后的細(xì)胞培養(yǎng)物接種Vero細(xì)胞單層兩瓶，接種量為細(xì)胞培養(yǎng)液的10%，于37℃中培養(yǎng)，設(shè)未中和的細(xì)胞培養(yǎng)物對照兩瓶，同時設(shè)正常細(xì)胞對照兩瓶，逐日觀察CPE情況。

2 結(jié)果

2．1 病毒的分離 在接毒細(xì)胞的前3代沒有出現(xiàn)明顯病變，但盲傳至第4～5代時，出現(xiàn)規(guī)律性細(xì)胞融合。如圖1所示在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時間出現(xiàn)的細(xì)胞病變。

2．2 蝕斑克隆結(jié)果 克隆3次，直徑0．3～0．5，0．5～0．8及0．7～0．9mm 的克隆株各1個，經(jīng)TCID50鑒定 ，0．1mL TCID50均在104．5以上。

2．3 RT－PCR擴增試驗結(jié)果 用引物F1、F2對病毒株CDV／R－20／12的細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA進(jìn)行RT－PCR擴增，PCR產(chǎn)物的電泳條帶約324bp（圖2），表明此毒株為犬瘟熱病毒。

2．4 F基因測序結(jié)果 用犬瘟熱引物F3、F4對病毒株CDV／R－20／12的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果擴出1條1 053bp的電泳條帶（圖3），PCR產(chǎn)物經(jīng)過克隆后測序，所得序列（圖4）與GenBank的CDV序列進(jìn)行比對，證明所得的毒株序列確實是CDV病毒序列。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)病變情況

2．5 病毒感染力測定結(jié)果 按Reed－Muench的計算方法，計算前10代病毒的TCID50，計算結(jié)果如下表（表1）。

2．6 血清中和試驗結(jié)果 用CDV參考陽性血清與該毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行中和試驗，結(jié)果該分離株可被完全中和，未中和的培養(yǎng)物對照兩瓶均病變，正常細(xì)胞均未病變，表明該分離毒株為CDV。

3 討論

本試驗在貉取皮期，在未發(fā)病的烏蘇里貉養(yǎng)殖場中，從肺臟和腹水中收集巨噬細(xì)胞，應(yīng)用ELISA篩選犬瘟熱陽性樣本，通過Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)，能看出典型CPE，經(jīng)蝕斑克隆純化，RT－PCR鑒定以及血清學(xué)試驗，證明獲得1株犬瘟熱毒株。病毒經(jīng)20代傳代培養(yǎng)，可以在Vero細(xì)胞穩(wěn)定生長，TCID50維持在104．5～5．5／0．1mL之間。

目前對CDV感染的動物還沒有特異的治療方法，目前對家犬犬瘟熱的治療多采用對癥治療、抗犬瘟熱血清和單克隆抗體法進(jìn)行治療。但是，對于毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)，這種治療方法不夠經(jīng)濟(jì)，不能夠普及利用［1］。因此，研制有效的疫苗顯得尤為重要，本試驗中分離的毒株并未導(dǎo)致貉子發(fā)病，需要更進(jìn)一步的試驗研究，從而確定該毒株是否為弱毒株，進(jìn)而為貉源犬瘟熱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

圖4 CDV分離毒株F蛋白基因部分序列

表1 Vero細(xì)胞病毒液1～10代的TCID50

［1］ 譚婷婷，張立恒，劉志平，等．狐源性犬瘟熱病毒抗血清的制備及其初步應(yīng)用［J］．中國獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：73－74．

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［3］ 劉瀾瀾，華育平，曾祥偉，等．狐貉源犬瘟熱病毒核蛋白基因的克隆及序列比較分析［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，35（9）：61－63．

［4］ Lan N T，Yamaguchi R，Kawabata A，etal．Stability of canine distemper virus （CDV）after 20passages in Vero－DST cells expressing the receptor protein for CDV ［J］．Veterinary Microbiology，2006，118：177－188．

［5］ 蘇鳳艷，魏吉祥，王卓聰，等．犬瘟熱病毒水貂株的分離與鑒定［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，38（2）：79－82．

［6］ 蘇鳳艷，宗春苗，王卓聰，等．水貂源犬瘟熱病毒的分離鑒定［J］．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，34（6）：674－677．

［7］ 葉俊華，夏咸柱，徐玉生，等．．幾種犬瘟熱弱毒疫苗免疫效果比較研究［J］．江西畜牧獸醫(yī)雜志，2003，2：37－38．