奶牛乳房炎無乳鏈球菌的分離鑒定

史秋梅，張艷英，高桂生，高光平，邵新華，梁銀聚，劉會然

（1．河北省預防獸醫學重點實驗室 河北科技師范學院動物科技學院，河北 昌黎066600；2．河北新華科級獸藥有限公司，河北 欒城051430）

奶牛乳房炎是世界乳牛業的主要危害因素之一，無乳鏈球菌是牛群中乳腺炎的重要傳染性病原菌，對規模飼養的奶牛，其危害是相當嚴重的。試驗證明［1］，犢牛時期飼喂含有無乳鏈球菌的乳汁，并在同欄飼養到產犢時，無乳鏈球菌性乳腺炎的發病率很高。據報道［2］，無乳鏈球菌可引起新生兒敗血癥、腦膜炎、呼吸道和婦女生殖感染等。目前無乳鏈球菌對奶牛業和人的健康帶來的危害已經引起了國內外學者廣泛的關注。隨著分子生物學技術的發展，PCR技術在檢測致病菌方面得以廣泛應用，并且展現出其快速、特異的優勢和前景。國內外對無乳鏈球菌的檢測方法已有一定的相關研究基礎。吳潤等［3］利用已知無乳鏈球菌16SrRNA序列設計特異性引物，通過PCR方法鑒定無乳鏈球菌。曹隨忠等［4］根據Gen－Bank中收錄的序列，參考無乳鏈球菌和停乳鏈球菌在16SrRNA與23SrRNA之間的間隔區設計引物，建立了特異性診斷方法。近年來，國內或國外都較普遍采用易操作、快速的PCR無乳鏈球菌檢測方法［5］，國內賈玉萍［6］等建立的巢式PCR方法，檢測無乳鏈球菌16SrRNA，可檢測到1CFU／mL的鏈球菌。這對于鏈球菌性乳房炎的早期預防及監測具有重要意義。因此，本試驗將傳統的細菌學鑒定方法和PCR快速檢測方法相結合對無乳鏈球菌進行鑒定，旨在為奶牛乳房炎的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 菌株 來自河北秦皇島周邊地區的某奶牛養殖場，患乳房炎病牛的牛乳，菌株編號同奶牛編號。菌株數編號為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；奶牛編號依次為：2647、56、2、3089、0808、68303、0014、16635、52129、0547。無乳鏈球菌標準株（C55934）、豬鏈球菌標準株（C55914），購自中國獸醫藥品監察所。

1．2 主要試劑 普通營養瓊脂（批號：20090808），6%兔鮮血營養瓊脂常規制備，營養肉湯（批號：2090120）LB營養肉湯（批號：010709），細菌生化鑒定試劑盒，均購自北京陸橋生物技術有限責任公司。溶菌酶、蛋白酶K為Solarbio公司產品；Taqplus DNA Polymerase、dNTPs、Marker DL－600為 TaKaRa 公司產品；鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒（Streptococcus Gruping kit），批號：786536601，為法國梅里埃（BioMerieux sa）公司產品。

1．3 主要儀器 TGL－16G臺式高速離心機，上海安亭科學儀器廠；恒溫培養振蕩器（ZHWY－103B），上海智城分析儀器制造有限公司；PCR擴增儀，東勝創新生物科技有限公司。

1．4 奶樣采集 從河北秦皇島周邊地區某奶牛養殖場，選取10頭牛的奶樣作為試驗樣本。樣本牛選擇的標準：奶產量與以往比較有所下降；乳房和乳頭都無明顯臨床型乳房炎表現；未患傳染病（如結核病、布魯菌病等）。每頭樣本奶牛采集奶樣10mL。采樣前，用溫水對乳房進行清洗，然后用0．2%新潔爾滅擦洗，最后用75%酒精消毒乳頭。擠奶樣時，去掉頭2～3把奶以避免污染一些雜菌。將奶樣分別裝入滅菌的小瓶中，加蓋封緊，標明牛號、乳室和日期，儲放冰盒送實驗室，立即進行檢測。

1．5 形態學檢查 將每份乳樣分別離心集菌，沉淀進行涂片，革蘭染色后置于顯微鏡下觀察細菌的形狀、染色特性，初步判斷樣本中有無鏈球菌。

1．6 細菌的分離培養 將奶樣離心集菌，在無菌條件下取離心沉淀乳樣劃線接種于5%兔鮮血瓊脂中37℃培養24h后觀察菌落形態。在兔鮮血瓊脂平板中挑取疑似菌落經革蘭染色后鏡檢，同時挑取疑似菌落接種兔鮮血瓊脂培養基上純培養。

1．7 生化鑒定 無菌挑取上述純培養物，進行以下項目的生化鑒定：過氧化氫酶試驗、乳糖、七葉苷、甘露醇、水楊素、棉子糖、山梨糖、單糖、木糖、纖維二糖發酵試驗等。

1．8 蘭氏分群 將上述待檢菌株接種于鮮血培養基，經過37℃培養24h，然后分離菌株選取2～3個菌落在含有0．4mL酶消化液的EP管內，振蕩混勻，37℃恒溫孵育10min。將試劑盒內的A、B、C、D、F、G型乳膠混勻后，分別取一滴滴在反應卡片的相應位置，再取消化好的菌液滴一滴于乳膠滴旁，用混勻棒將兩滴液體充分混勻，輕微晃動2min后判定結果，如果出現明顯的凝集顆粒為陽性，如果出現凝集的均勻混懸液為陰性。并設生理鹽水空白對照、A～G群混合陽性抗原對照和標準無乳鏈球菌C55934、豬鏈球菌C55914株對照。

1．9 巢式PCR檢測

1．9．1 基因組DNA的提取 分別制備無乳鏈球菌標準菌株DNA、臨床分離菌株DNA模板。方法如下：挑取上述細菌純培養物的單個菌落接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，收集菌液并分裝于1．5mL離心管13 000r／min（4℃）離心30s，將菌體懸于400μL 50mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA）液，后加入50μL溶菌酶（1 000mg／mL）混勻放于37℃溫育30～60min，期間緩慢搖動。然后加入250μL STEP溶液，50℃緩慢搖動至少2h，分兩管做。0．7 mL溶液中加入1mL純化樹脂顛倒混勻5～6次，室溫下溫育3min其間顛倒混勻1次，5 000r／min離心3s，收集沉淀。用1mL GN結合液將純化樹脂顛混勻5 000r／min離心3s，收集沉淀。用0．5mL漂洗液漂洗純化樹脂兩次顛倒混勻5 000r／min離心，收集沉淀。用0．8mL乙醇懸浮純化樹脂裝入離心柱13 000r／min離心1min。然后倒掉收集管中的乙醇放入離心柱內，轉速為13 000r／min離心1min，盡量除盡乙醇然后將純化柱套入干凈的1．5mL離心管中，開蓋放置2～3min，加入100mLTE緩沖液與純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫放置3min。13 000r／min離心2min，最后取2μL（1%瓊脂糖電泳）檢測，－20℃保存備用。

1．9．2 擴增 從GenBank中查得鏈球菌屬16S rRNA的序列，用DNAStar軟件進行比較分析，在保守區設計鏈球菌屬的通用引物L1和L2；在保守區之間，無乳鏈球菌的可變區設計特異引物A1和A2。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：L1：5′－GCGTGCCTAATACATGCAA－3′；L2：5′－TACAAC－GCAGGTCCATCT－3′。A1：5′－TTTGGTGTTTACTAGACTG－3′；A2：5′－TGTGTTAATTACTCTTATGCG－3′。外側擴增25μL體系用引物L1和L2對提取的DNA進行PCR擴增。PCR混合液組成：10×PCR Buffer 2．5μL，4×dNTP 2μL（2．5 mmoL／μL），1μL（25mmoL／μL）MgCl2，引物 L1和L2各2μL（10pmoL／μL），rTaqDNA酶1．5U，模板2μL，加雙蒸水補足25μL。同時設定陰性對照和陽性對照。擴增反應條件：94℃變性4min，94℃45s，52℃45s，72℃45s，共25個循環。最后72℃延伸5 min。PCR產物5μL用1．0%瓊脂糖凝膠進行電泳。90V電泳30min，紫外燈下觀察結果。以DL－2 000作為分子質量標準。內側擴增25μL體系用A1和A2引物進行PCR擴增。取外側擴增產物2μL作為模板，反應體系其他組成及條件同外側擴增。

2 結果

2．1 形態學檢查 菌落較小，呈β型溶血。經革蘭染色后鏡檢可見菌體呈圓形或卵圓形，排列成短鏈狀，革蘭染色陽性。

2．2 生化鑒定 各項生化反應結果見表1。

無乳鏈球菌易溶解過氧化氫酶，能發酵乳糖呈陽性，在6．5%NaCl中不生長，七葉苷、甘露醇、山梨醇、棉子糖、水楊素呈陰性。碳源與氮源利用方面：根據該試驗判斷出6株菌為B群鏈球菌，符合無乳鏈球菌的特征。因此2547、2、68303、3089、56、0808編號的細菌為無乳鏈球菌。

2．3 蘭氏分群 各菌株分群結果見表2。

表1 無乳鏈球菌生化鑒定

表2 各菌株分群

通過蘭氏分群試驗證明其細菌是B群的有2547、56、2、3089、0808、68303。上述編號均為無乳鏈球菌。其中68303為微弱凝集的B群。標準菌株無乳鏈球菌C．55934為蘭氏B群，豬鏈球菌C55914為蘭氏D群。

2．4 基因組DNA的提取 通過電泳觀察得出提取的菌株基因組DNA帶整齊、大小一致。通過采用巢式PCR檢測，用引物L1和L2外側擴增的產物，分離株2547、2、68303、3089、56、0808在207bp處有帶，無乳鏈球菌C55934擴增陽性，豬鏈球菌C55914擴增陽性，見圖1。用引物A1和A2內側擴增的PCR產物標準菌株無乳鏈球菌C55934和分離株2547、2、68303、3089、56、0808有121bp的目的條帶，陰性對照株豬鏈球菌C55914則沒有，見圖2。

圖1 巢式PCR無乳鏈球菌外側擴增產物

圖2 外側擴增產物無乳鏈球菌內側擴增產物

3 討論

本試驗采用巢式PCR檢測方法對無乳鏈球菌進行了檢測，結果均得到預期相符的207bp的目的片段，通過PCR檢測方法檢測結果與生化鑒定結果的符合率達100%。

奶牛乳腺炎診斷是奶牛乳腺炎防治的第一重要步驟。傳統的檢測無乳鏈球菌的方法有理化檢測法和體細胞間接檢測法，但檢測的對象只是牛奶中體細胞及炎性細胞碎片。其原理是患有乳腺炎的奶牛因乳腺炎癥反應，受損的乳腺細胞和炎性細胞崩解成碎片。炎癥嚴重者，則細胞碎片越多，根據診斷液與碎片反應強弱的程度，可判斷炎癥的等級。該法雖非常實用，但不具有特異性，且通過目測判定等級，準確度不很高。本試驗結果表明，我們采用取奶樣作細菌分離培養，再結合生化特征鑒定及血清學鑒定，將初步鑒定為無乳鏈球菌的菌株；過夜培養后巢式PCR檢測方法檢測結果與生化鑒定結果的符合率達100%。國內許多地方都分離到了無乳鏈球菌，李宏勝等［7］采集了成都、蘭州、鄭州、濟南、哈爾濱、南昌6個城市各種類型乳房炎奶樣280頭份（340個乳室），經細菌分離鑒定共分得12種316株菌，無乳鏈球菌總的分離率為15．56%。雙金等［8］共檢測內蒙古泌乳牛283頭次1 078個乳區，隱性乳房炎的頭陽性率為61．84%，無乳鏈球菌的分離率為20．83%。劉佩紅等［9］對通過上海32個規?；膛?33份奶樣的分離鑒定，共分離出254株細菌，其中無乳鏈球菌的分離率9．8%。

本試驗利用鏈球菌屬（Streptococcus）16S rRNA基因的保守區設計通用引物作為鏈球菌屬的陽性控制，在保守區內的可變區設計無乳鏈球菌特異的引物。試驗結果表明，通過奶樣中無乳鏈球菌的增菌培養，簡便、快速提取DNA和特異性PCR反應，可以檢測到奶樣中的無乳鏈球菌，可以用作牛群中無乳鏈球菌感染的早期流行病學調查。

［1］ 聶建超．談談奶牛乳房炎的病因及防治［J］．吉林畜牧獸醫，2002，9：22－24．

［2］ 馬保臣，杜平，蔣世峰，等．奶牛乳腺炎的研究進展［J］．動物科學與動物醫學，2002，19（9）：21－24．

［3］ 吳潤，郝保青．奶牛隱性乳房炎的主要病原菌的PCR鑒定［J］．中國牛業科學，2006，36（8）：1202－1208．

［4］ 曹隨忠，杜立新，趙興緒，等．16S－23SrRNA間隔區在奶牛乳房炎診斷中的應用［J］．中國畜牧獸醫，2005，32（2）：26－27．

［5］ 焦振泉，劉秀梅．細菌分類與鑒定的新熱點：16S～23SrDNA間區［J］．微生物學通報，2001，28（1）：85－89．

［6］ 賈玉萍，周東順．巢式PCR檢測無乳鏈球菌16SrRNA方法的建立及應用［J］．農業生物技術學報，2005，5：668－671．

［7］ 李宏勝，郁杰，羅金印，等．我國部分地區個體奶牛場乳房炎細菌學調查［J］．中獸醫醫藥雜志，2002，6：14－17．

［8］ 雙金，嘎爾迪，包鵬云，等．奶牛隱性乳房炎的發生規律及其致病菌的分離鑒別與藥物敏感性試驗［J］．內蒙古農業大學學報，2001，22（1）：18－23．

［9］ 劉佩紅，黃忠，王健，等．奶牛乳腺炎的分離鑒定及耐藥性分析［J］．中國奶牛，2004，1：43－45．