1株鴻雁源新城疫強毒的分離鑒定

陳雪龍，吳海燕，王忠偉，郭 麗，齊艷萍，2

（1．黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶163319；

2．農業部農產品加工質量監督檢驗測試中心（大慶），黑龍江 大慶163319）

新城疫病毒（NDV）是一種嚴重危害養禽業的重要傳染病病原，曾經對全球養禽業造成嚴重經濟損失。過去一般認為水禽對NDV的易感性較差，多呈隱性感染［1］。然而自20世紀90年代以來，國內外愈來愈多的報道顯示NDV對水禽的致病力逐漸增強，鵝、鴨等水禽已成為易感禽類［2］。

2012年5月，黑龍江大慶某大雁養殖場的大雁（后鑒定為鴻雁）中發生了以輕微呼吸道癥狀和稀便、腿麻痹、站立不穩等為主要癥狀的疾病，使用多種抗生素治療無效。為了查明發病原因，采集了發病大雁病料，進行了病原分離鑒定工作。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及試驗動物 TRIzol試劑、M－MLV反轉錄酶、RNasin、dNTP，購自Invitrogen公司；ExTaqDNA 聚合酶、DNA Marker（DL－2 000），購自寶生物工程（大連）有限公司。NDV標準陽性血清、H5、H9亞型禽流感病毒（AIV）標準陽性血清、減蛋綜合征病毒（EDSV）標準陽性血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；陰性血清，購自瑞普生物藥業有限公司。PBS、1%雞紅細胞、雙抗（濃度為4 000IU（μg）／mL的青霉素與鏈霉素）按常規方法本實驗室自制。

實驗用1日齡及6周齡SPF雛雞和10日齡的SPF雞胚，均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。

1．2 病料處理 現場采集大慶某大雁養殖場發病鴻雁（Ansercygnoides）的腦、脾、肺、腸等組織。其后于實驗室內將病料剪碎研磨，用滅菌PBS按照體積比1∶4制備懸液，反復凍融3次后，8 000r／min離心10min，取上清加入雙抗，37℃作用1．5h，－20℃保存備用。

1．3 病毒分離與血清學鑒定 將病理處理后的上清液接種雞胚，每胚接種200μL，共接種4個10日齡SPF雞胚，每天照蛋3次，棄去24h內死亡的雞胚，收獲36～96h死亡雞胚的尿囊液進行血液凝集試驗（HA），若有血凝性再與NDV陽性血清、AIV陽性血清（H5／H9）和EDSV陽性血清進行血凝抑制（HI）試驗，操作方法按文獻［3］方法進行。

1．4 分離株F基因RT－PCR鑒定

1．4．1 引物設計 參照GenBank中發表的鴨NDVF基因序列設計一對通用引物，用于擴增F基因，序列如下：上游引物 P1：5′－GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA－3′，下游引物P2：5′－TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC－3′，預計目的擴增片段為535bp。

1．4．2 RT－PCR反應 取尿囊液，按照 TRIzol試劑說明提取病毒RNA，加入適量的DEPC處理水溶解。在 PCR 管中加入 RNA 10．5μL，10μmol／L dNTP 2μL，20μmol／L 上游引物2μL，5×RT Buffer 4μL，40U／μL RNasin 0．5μL；200U／μL M－MLV 1μL，反應總體積20μL，混勻在42℃水浴中作用1．5h。PCR反應體系采用25μL體系，模板cDNA 3μL，10×Buffer 3μL，F1、F2 引物各1 μL，dNTP 3μL，Ex－TaqDNA聚合酶1μL，DEPC水13μL。PCR反應條件為95℃3min，94℃40s，54℃30s，72℃1min，進行30個循環后，72℃延伸10min，最后取PCR產物5μL，在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳觀察結果。

1．5 NDV致病指數測定 參照文獻［4］方法進行致死雞胚平均死亡時間（MDT）、1日齡雛雞腦內接種致病指數（ICPI）和6周齡雛雞靜脈接種致病指數（IVPI）等NDV致病指數的測定。

1．5．1 MDT的測定 將尿囊液用滅菌PBS作10倍稀釋成10－6～10－10，每個稀釋度經尿囊腔接種6個10日齡SPF雞胚，0．1mL／個，置37℃培養，棄去24h內死亡雞胚，每日照蛋3～4次，連續觀察7d，記錄使所有雞胚死亡的最高稀釋度致死雞胚的平均時間（MDT）。

1．5．2 ICPI的測定 用滅菌PBS（1∶10）稀釋病毒尿囊液，接種10只1日齡的非免疫雛雞，每只腦內接種0．05mL。每天在與接種相應的時間觀察雞群的健康狀況，并對試驗雞進行評定：正常記0分，發病記1分，死亡記2分。連續觀察8d，最后計算ICPI。

1．5．3 IVPI的測定 將分離株尿囊液以PBS稀釋10倍，翅靜脈接種6周齡SPF雞10只，0．1 mL／只，每天在與接種相應的時間檢查雞群的健康狀況，連續觀察10d。記錄正常、發病、麻痹與死亡雞的每日累計數，最后計算IVPI。

2 結果

2．1 鴻雁臨床癥狀及剖檢變化 現場觀察病雁表現一定程度的精神不振，食欲和飲水減少；鼻孔流出少量清亮水樣液體，張口伸頸呼吸；腹瀉，排白色、黃色或黃白色稀便；翅膀下垂，雙腿輕微麻痹無力，站立不穩或者不愿行走。

經剖檢觀察：腹段食管黏膜有白色壞死點；腸黏膜嚴重壞死脫落并伴有較為嚴重的出血；脾臟色暗紅并腫大，可見不規則的灰白色壞死點；肺臟表面有纖維素性滲出物形成纖維性假膜；肝臟邊緣散在有針尖大出血點和黃白色壞死點，膽囊壁增厚并擴張；腺胃乳頭有出血點，與肌胃交界處出血或有潰瘍灶；心外膜和心內膜均有出血點，并有白色壞死灶；腦輕微水腫、充血；其他組織或器官無肉眼可見病變。

2．2 病毒的分離與初步鑒定結果 雞胚接種后，大多數在接種后45～70h死亡，胚體有出血現象，尤其胚體的頭、頸和爪出血嚴重。收集死亡雞胚的尿囊液，HI試驗測得死亡雞胚的尿囊液均具有血凝價（6～9lb）。分離株的這種血凝性可被NDV標準陽性血清所抑制，而不能被流感 H5、H9亞型AIV和EDSV陽性血清所抑制，說明分離毒為NDV，命名為DQBT01。

2．3 分離株F基因RT－PCR擴增鑒定結果 對病毒尿囊液進行F基因的RT－PCR擴增后，將擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，檢測結果如圖1所示：

圖1 NDV F基因RT－PCR擴增結果

如圖1所示，對照DNA相對分子質量標準，NDV特異性檢測引物的擴增片段長度為535bp，擴增結果與預計片段大小相同，因此可以進一步判斷此分離毒為NDV。

2．4 NDV的致病指數測定結果

2．4．1 MDT的測定結果 分離毒株尿囊液接種10日齡SPF雞胚后的死亡情況見表1，從表中可見，引起全部雞胚致死的最高稀釋度為10－8，經計算，MDT為55h。

表1 DQBT01分離株MDT測定

2．4．2 ICPI測定結果 1日齡雛雞腦內接種分離病毒發病及死亡情況見表2，雛雞接種后2～4d后出現典型癥狀進而死亡。雛雞剖檢見腺胃黏膜充血，十二指腸充血、出血。經計算ICPI為1．68。

表2 DQBT01分離株ICPI測定

2．4．3 IVPI測定結果 6周齡SPF雞靜脈接種分離病毒發病及死亡情況見表3，接種后第2天雛雞開始出現癥狀并有2只死亡，在接種第四天SPF雞全部死亡，剖檢主要在腺胃和肌胃交界處有出血斑或出血帶，腺胃黏膜腫脹充血。按公式計算：IVPI為2．54。

表3 DQBT01分離株IVPI測定

3 討論

本試驗從發病死亡的鴻雁體內分離得到1株病毒，該病毒可使SPF雞胚出現全身出血性變化，死亡雞胚的尿囊液經過血清學試驗以及NDVF基因RT－PCR擴增證明該病毒株為 NDV，命名為DQBT01。該病毒MDT、ICPI和IVPI致病指數分別為55h、1．68、2．54，按照 OLE標準屬于 NDV強毒株。

NDV對鳥類感染宿主范圍比較廣，目前經過報道的野禽已達200多種［5－7］，一般情況下，野禽在自由生活狀態下對NDV的有較強的抵抗力，因此所分離的NDV大部分為弱毒株。而在人工飼養條件下，多種野禽可以感染NDV并發病，其涉及的公共衛生問題也受到了高度關注。目前在我國越來越多的野禽感染NDV并且發病的報道越來越多［8］，涉及的物種也開始增多，大雁感染NDV并且發病的報道也有少量報道［9］，而前人認為水禽對于NDV可以攜帶而不發病，因此認為水禽對NDV有較強的抵抗力。然而，隨著鵝、鴨、大雁等水禽感染NDV并且發病的報道逐漸增多，說明在我國NDV的致病性有增強的趨勢［10］。同時NDV在野禽和家禽間存在相互感染并傳播的現象，并且在相互傳遞的過程隨著宿主免疫系統的選擇壓力不同，NDV存在著一定程度的變異，這種變異可能導致毒力變強，而這種變異趨勢已引起研究者的高度關注，如有研究報道，野禽中自然存在的無毒力毒株，但當其在雞群中傳播時，則具有變成高致病性病毒的能力［11］，這對于我國的養禽業是嚴重的威脅。

本次從鴻雁體內分離出NDV強毒株，為野生水禽在人工飼養條件下感染NDV并發病提供了相關依據，提示禽類養殖業，特別是水禽養殖業，對于NDV的防疫要引起足夠的重視，這對于我國控制ND的傳播和流行，降低養殖戶的損失具有重要意義。

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