豬瘟病毒感染對豬外周血細胞因子轉錄的影響

范學政，陳 鍇，徐 璐，朱長康，張正興，趙 燕，史蘭廣，鄭 然，寧宜寶，王 琴，鄭世軍

（1．中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；2．中國獸醫藥品監察所，北京 海淀100081；3．四川農業大學動物醫學院，四川 雅安625014）

豬瘟（ClassicalSwineFever，CSF）是由豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，并世界動物衛生組織（OIE）被列為必須報告的疫病之一，在我國被列為一類動物疫病［1］。近年來，豬瘟的流行方式和病癥特點已發生了顯著變化，出現了所謂非典型性和溫和性豬瘟，并造成持續感染［2］。因此豬瘟病毒致病機理的研究，特別是對病毒與宿主互相作用的研究為人們所關注，其中細胞免疫反應相關機制尤為受到重視。CSFV感染巨噬細胞后能夠誘導多種細胞因子的表達，并能通過此種方式抑制豬的非特異性免疫并延緩豬的特異性免疫應答，白介素、干擾素及其調控因子和腫瘤壞死因子等抗病毒相關因子在調控過程中起關鍵作用。為進一步了解CSFV毒株對豬體免疫系統的調節，本試驗使用中等致病力CSFV毒株人工感染試驗豬后，定期采集豬外周血，提取總RNA運用qRT－PCR技術對免疫相關因子的mRNA轉錄水平進行分析。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病毒與細胞 CSFV 毒株 HeBHH1／95（TCID50為10－3．5／0．2mL），由中國獸醫藥品監察所豬瘟參考實驗室分離保存，屬中等致病力毒株［3］。

1．1．2 試驗動物及分組 15頭試驗豬為三元長白豬，購自河北保定山區，為非免疫豬群，30日齡、體重約7～10kg、健康狀況良好、經檢測CSFV、BVDV、PRRSV、PCVII、PRV、PPV和FMDV等抗原抗體陰性，試驗前隔離觀察1周。試驗時隨機分成感染組和空白對照組。感染組在負壓潔凈室飼養，對照組在正壓潔凈室飼養。

1．1．3 熒光定量PCR主要試劑 SYBR?Premix ExTaqTM（Perfect Real Time）試劑盒為TaKaRa公司產品；SuperScriptTMⅢ（200U／μL）反轉錄酶為Invitrogen公司產品。

1．2 方法

1．2．1 動物感染和樣品采集 將15頭試驗豬飼養至40日齡后，隨機挑選5頭作為對照組，10頭作為感染組，隔離飼養。采用肌肉注射（0．5mL／頭）接種HeBHH1／95株進行感染，對照組每頭注射0．5 mL細胞培養液。感染后，每天記錄體溫并觀察感染組和對照組試驗豬的食欲、體溫、糞便、精神狀態以及眼瞼、結膜和皮膚等部位有無病變特征，并根據Everett等的方法對試驗豬進行臨床癥狀打分［4］，感染組和對照組分別在 0dpi、1dpi、2dpi、5dpi、7 dpi、9dpi、12dpi、16dpi、20dpi、23dpi、28dpi、30 dpi、35dpi、43dpi采集抗凝血5mL，分離PBMC，對照組做平行處理。

1．2．2 相對定量PCR對各細胞因子基因轉錄水平進行檢測 對1．2．1中分離的PBMC樣品進行RNA抽提，抽提的RNA用SuperScriptTMⅢ反轉錄酶進行cDNA 合成。應用SYBR Premier ExTaqTM試劑盒進行 Real time RT－PCR，以豬β－actin基因作為內參，各因子引物及循環條件按參考文獻［5］進行。最后將檢測結果進行分組分析。

2 結果

2．1 試驗豬的臨床癥狀及體溫變化 感染組在感染后1～4dpi，食欲、精神和體況均正常。3dpi后感染組體溫上升，開始出現輕微精神輕度沉郁，進食減少。8dpi體溫超過40℃，精神沉郁，食量下降。有6頭豬持續高燒8～10d后體溫快速下降并死亡，期間精神重度沉郁，食欲廢止，眼角出血，共濟失調，食欲廢止，眼角出血，喜臥，步態不穩，全身潮紅，在18dpi開始出現試驗豬死亡。有4頭豬耐過，體溫在高燒5～7d后緩慢下降并恢復正常。對照組豬未出現上述臨床癥狀。

從臨床打分來看，在5dpi感染組的臨床得分開始升高，在21dpi時達到最高峰，耐過豬在21d后臨床得分開始下降，死亡豬與耐過豬臨床得分詳見圖1。

圖1 CSFV感染后試驗動物臨床得分統計

根據試驗動物的臨床表現，將感染過程分為感染早期（體溫升高至40℃，初步出現豬瘟感染典型癥狀，1～10dpi），癥狀明顯期（食欲不振、共濟失調，出現嚴重豬瘟感染典型癥狀，約11～20dpi），瀕死期（瀕臨死亡，約20～24dpi）3個時期，將各時期采集的數據（感染早期10頭，癥狀明顯期10頭，瀕死期6頭）進行統計分析。

2．2 CSFV感染后外周血PBMC免疫相關因子轉錄水平檢測

2．2．1 干擾素及其調控因子轉錄水平檢測 在感染早期，Ⅰ型干擾素IFN－α，IFN－β轉錄水平上升顯著，RQ值均大于14，IFN－γ轉錄水平（RQ＝1．08）提高幅度低于IFN－α，IFN－β，干擾素調控因子中MxA轉錄水平顯著上升（RQ＝230．58），PKR（RQ＝0．375）和OAS（RQ＝5．47）轉錄水平雖有提高，但與MxA相比提高并不顯著。癥狀明顯期時，IFN－α，IFN－β，IFN－γ轉錄水平持續提高；干擾素調控因子MxA與感染早期相比轉錄水平顯著降低，與此相反的是PKR的轉錄水平上升顯著；在整個感染過程中，OAS轉錄改變不大。在瀕死期，干擾素及其調控因子轉錄水平均較癥狀明顯期呈下調趨勢（RQ＜0），見圖2。

圖2 CSFV感染后干擾素及其調控因子變化

2．2．2 白介素類細胞因子轉錄水平檢測 在感染早期，IL－1α（RQ＝3．77），IL－1β（RQ＝4．03），IL－2（RQ＝25．98）、IL－4（RQ＝15．86）、IL－8（RQ＝4．47）轉錄水平上升顯著，IL－6轉錄水平并不顯著（RQ＝0．74）；癥狀明顯期是，IL－6（RQ＝27．99）轉錄水平提高顯著，IL－1α、IL－2、IL－4、IL－8轉錄水平持續提高，IL－6轉錄水平略有下降；在瀕死期，除IL－1α，IL－1β外所檢測的白介素類細胞因子轉錄水平均較癥狀明顯期均呈下調趨勢（RQ＜0），見圖3。

2．2．3 其他類細胞因子轉錄水平檢測 在感染早期，肺泡巨噬細胞趨化因子1（RQ＝28．45）和肺泡巨噬細胞趨化因子2（RQ＝13．16）轉錄水平顯著上升，腫瘤壞死因子（RQ＝3．61）轉錄水平雖有提高但是較肺泡巨噬細胞趨化因子1和肺泡巨噬細胞趨化因子2為低。在癥狀明顯期，肺泡巨噬細胞趨化因子1（RQ＝9．08）較感染早期轉錄水平略有降低，而肺泡巨噬細胞趨化因子2轉錄水平進一步升高至0dpi的40余倍，TNF維持感染早期轉錄水平不變。在瀕死期，3種細胞因子轉錄水平均呈下調趨勢（RQ＜0），見圖4。

圖3 CSFV感染后白介素及其調控因子變化

圖4 CSFV感染肺泡巨噬細胞趨化因子和腫瘤壞死因子變化

3 討論

CSFV強致病力毒株感染后能夠造成幾乎100%的死亡率，而中等致病力毒株感染后造成的死亡率較低，且能損傷免疫系統使得耐過豬可轉變為CSFV慢性感染豬，而細胞因子在感染機體免疫應答中起重要的作用。因此，通過使用中等致病力CSFV毒株感染試驗用豬，在感染過程中對這些關鍵的抗病毒基因在mRNA水平上進行定量檢測，可以了解野毒感染過程中免疫應答的激發和調控。

機體對CSFV感染進行的免疫應答中，PBMC細胞群體及其分泌的白介素類和干擾素類細胞因子起著重要的作用。干擾素是抗病毒感染中最重要的免疫因子之一，除可以直接限制病毒的復制和擴散外，還具有強大的免疫調節作用，當病毒粒子進入機體并被受體識別后，IFNα／β在細胞內的快速產生，是機體抵御病毒感染的第一道防線。黃病毒科病毒的Npro蛋白是IFNα／β表達的拮抗物，能抑制dsRNA的表達和病毒介導的IFNα／β的表達，缺失了Npro基因的CSFV不能在加入IFNα／β的細胞中復制［6］。在本試驗中，在感染早期和癥狀明顯期，IFNα／β轉錄水平高于IFN－γ，Ⅰ型干擾素通路在抗豬瘟病毒感染中發揮了關鍵作用。MxA基因在Ⅰ型干擾素（IFN－α／β）或病毒誘導下可表達具廣譜抗病毒作用的Mx蛋白，研究中感染早期MxA基因的轉錄水平提高極其顯著，但在癥狀明顯期時轉錄水平較感染早期為低，而PKR轉錄水平顯著提高，提示在CSFV感染和臨床癥狀的不同階段干擾素對其作用元件的選擇不同，此種改變是宿主與病毒共同作用的結果。

IL－1主要由單核巨噬細胞產生，可剌激B細胞分化和分泌抗體，并刺激T細胞分化及IL－2和IFN－γ的產生，刺激嗜中性粒細胞產生，提高NK細胞殺傷活性，增強機體免疫功能，在炎癥和免疫方面起關鍵遞質的作用。IL－6是一種廣泛的促炎細胞因子，能直接刺激B細胞分泌IgA，并可通過刺激補體成分引起抗體反應，間接增加IgA分泌［7］，同時還促進CTL分化，并協同IL－2增強CTL穿孔素基因的表達并增加T細胞IL－2產生和IL－2受體的表達。IL－6 和 IL－1 能 激 活 內 皮 細 胞 釋 放 IL－8 和MCP、表達粘附因子（adhesion molecules），誘導粒細胞進入炎性區域。在包括CSFV在內的單鏈RNA病毒的感染中，這兩種細胞因子均能強有力的介導血管滲透性，并能間接的誘導包括高熱、血凝等癥狀［8］。TNF的重要功能之一是參與細胞的凋亡。本實驗室的前期研究中發現，CSFV感染后能夠引起外周血免疫細胞的凋亡，在本次試驗中，驗證了CSFV感染TNF轉錄水平顯著提高，證明了豬瘟病毒、TNF轉錄水平和細胞凋亡之間的關系，在國外同類 研究中發現，CSFV感染試驗豬的脾臟和淋巴結中有同樣現象出現。此外，趨化性細胞因子，如AMCF 1，2（肺泡巨噬細胞趨化性因子1，2）和IL－8家族蛋白在體內和體外均是嗜中性粒細胞的化學引誘物，與CXC v因子協同，促進白細胞的再生［9］。

本次試驗感染豬在整個試驗過程中及剖檢后的眼觀變化出現了豬瘟病毒亞急性感染的典型癥狀，通過qRT－PCR對CSFV感染后豬外周血淋巴細胞的11種細胞因子mRNA的轉錄水平的分析，表明CSFV感染可以導致PBMC細胞分泌的細胞因子mRNA轉錄水平增高，從而影響機體的細胞免疫應答和體液免疫應答功能。

［1］ 一、二、三類動物疫病病種名錄，中華人民共和國農業部公告（第1125號）［EB］．2008年12月．

［2］ 寧宜寶，王琴，趙耘．豬瘟病毒持續感染與豬瘟預防控制［J］．中國獸藥雜志，2005，39（5）：331－335．

［3］ 王琴，寧宜寶，趙耘，等．9株豬瘟分離毒株的致病特性［J］．中國獸醫學報，2007，27（2）：145－149．

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