炭疽桿菌雙重實時熒光PCR檢測方法的建立

譚維國，陳文琦，呂 恒，劉 玉，王 平，陳鳳娟，王長軍，張錦海

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

炭疽桿菌能引起羊、牛、馬等動物及人類的炭疽病，嚴重威脅公眾財產、健康和生命安全，并且可形成氣溶膠通過空氣飛沫傳播，易引發突發公共衛生事件，也常常被視為首選的生物恐怖/生物戰病原［1-2］。目前的炭疽桿菌檢測方法，主要基于對病原體的培養、染色鏡檢、血清學(抗原或抗體)檢測等，但這些方法均不適合早期快速偵檢，難以適應戰時疫情控制的需要［3-4］。本研究選擇了炭疽桿菌PX01質粒的保護性抗原PA基因、PX02質粒的莢膜合成相關基因capA基因作為檢測靶基因，從而建立了一種雙重實時熒光定量PCR的方法，能區分強毒株、弱毒株或無毒株，對于應對突發傳染病疫情和流行病學調查、突發公共衛生事件應急處置的早期檢測、及反生物恐怖襲擊預警等具有重要的意義，并已應用在某次重大保障活動中。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株和質粒:炭疽桿菌強毒株(軍事醫學科學院五所微檢中心);大腸埃希菌XL10-Gold株(美國Stratagene公司);線性化質粒載體pGEM-T easy(美國Promega公司)。②主要試劑:DNA提取液(25 mM NaOH、10 mM Tris-HCl、1%Triton X-100、1%NP-40、0.1mM EDTA、2%Chelex-100)、Pyrobest Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、DNAMarker DL2000、DNA純化及片段回收、抽提質粒試劑盒、RNase H酶TliRNase H II、Taq DNA聚合酶Ex Taq HS等，均為TaKaRa公司(大連)產品;細菌DNA抽提試劑盒(北京天根公司)。③主要設備:ABI 7500 Fast型實時熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司，配套軟件SDS2.04)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設計 通過分別對NCBIGen-Bank中的炭疽桿菌的PA基因和capA基因序列，使用Beacon Designer等多種生物學軟件，結合經驗判斷和人工比對、修正，進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的核苷酸區域，各設計一對引物和探針。設計原則為:引物間和引物內無互補序列，而且分別特異性地針對各靶基因，相互間無交叉反應，溶解溫度(Tm值)相似，可在同一套反應體系中同時應用于檢測和區分炭疽桿菌的PA和capA基因。

1.2.2 引物對及探針序列的合成 委托Takara(大連)公司合成，引物、探針序列和雙標記的熒光基團見表1。

1.2.3 目標基因質粒標準品的制備 用細菌DNA抽提試劑盒按照說明書操作，從滅活的炭疽桿菌強毒株中提取基因組DNA。分別按表1的capA引物對序列、PA引物對序列，使用Pyrobest Taq DNA聚合酶對細菌基因組DNA進行PCR擴增，獲得對應的capA基因片段、PA基因片段目標基因擴增產物，送交南京金斯瑞生物公司，拼接克隆至PGEM-T easy載體，經測序驗證無誤，稱為 CapA-PA-PGEM質粒。將含CapA-PA-PGEM質粒的XL10-Gold細菌進行增菌，提取質粒DNA，用紫外分光光度計定量，利用阿伏加德羅常數公式(6.02×1023)×(ng/μl×10－9)/(DNA 長度 ×660)= 拷貝/μl計算拷貝數［5］，根據需要稀釋分裝，從而獲得同時含有capA基因序列和PA基因序列的質粒標準品，置－20℃備用。

1.2.4 反應體系 反應總體積25μl，采用正交設計L16(45)考察 Mg2+、dNTPs、引物濃度、探針濃度、Ex Taq HS酶五因素，在四個水平上進行優化試驗，最終確定的體系由以下組分構成:dNTP混合溶液(各2.5 mM)3 μl，MgCl2溶液(25 mM)5 μl，Tli RNase HⅡ(200 U/μl)0.5 μl，Ex Taq HS(5 U/μl)0.25 μl，10 ×Cycleave PCR Buffer 2.5 μl，PA、capA 引物對工作液(10μM)各1μl，PA探針工作液、capA探針工作液(均為5μM)各1μl，質粒標準品稀釋液1μl或樣本待測液4μl，最后以雙蒸水補足至25μl。

1.2.5 反應參數 第一階段:初期變性，95℃10 s;第二階段:PCR反應，為95℃變性5 s，55℃退火10 s，然后72℃ 25 s延伸，并在此步驟監測熒光曲線;重復50個循環以更好地觀察雙重實時熒光擴增曲線的形狀。判斷陽性的標準是:循環閾值(Ct值)在38以內且擴增曲線呈S型。

1.2.6 靈敏度實驗 將CapA-PA-PGEM質粒標準品作倍比連續稀釋，使其拷貝數濃度從5×106拷貝/μl至 5 ×10－1拷貝/μl，然后加入反應體系內進行雙重熒光PCR擴增，測定雙重實時熒光PCR的靈敏度。

1.2.7 特異性實驗 用建立的雙重實時熒光PCR檢測方法對課題組保存的炭疽桿菌強毒株核酸、鼠疫桿菌核酸、嗜肺軍團菌1型、鼠傷寒沙門菌、山夫登堡沙門菌、福氏志賀菌、宋內志賀菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌標準株(ATCC 25922)、弗勞地枸櫞酸桿菌、銅綠假單胞菌進行檢測比較。

1.2.8 實戰應用 在某次重大保障任務中，對解放軍總后勤部衛生部提供的一次實毒實樣(白色粉末)進行涂片革蘭染色后發現背景雜亂，并見少許革蘭陽性桿菌，隨即對粉末樣品用DNA抽提液按常規方法提取核酸，以本研究建立的雙重實時熒光PCR方法進行檢測分析。

表1 引物對及探針序列

2 結果

2.1 炭疽桿菌雙重實時熒光定量PCR反應熒光曲線圖 用本研究建立的方法，對炭疽桿菌強毒株核酸檢測的熒光曲線見圖1。

圖1 炭疽的CapA基因、PA基因的雙重實時熒光定量PCR擴增曲線

可見在單一反應孔中，同時成功檢測出capA基因、PA基因，擴增曲線良好，呈典型的S型

2.2 靈敏度 經梯度稀釋的CapA-PA-PGEM質粒標準品測試，本方法對capA基因、PA基因單檢的靈敏度分別為每反應5和50拷貝，見表2。

表2 炭疽桿菌雙重實時熒光定量PCR的檢測靈敏度

2.3 特異性 應用本研究的雙重實時熒光PCR方法，對保存的炭疽桿菌強毒株或核酸樣品的檢測結果均為陽性，而鼠疫桿菌、嗜肺軍團菌1型、枯草芽孢桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、大腸埃希菌標準株等形態相似桿菌、常見致病菌或條件致病菌的檢測結果均為陰性。

2.4 實戰應用 對解放軍總后勤部衛生部提供的實毒實樣，在嚴格生物安全防護條件下提取核酸后，應用本方法進行實戰應用檢測，結果陽性對照(質粒標準品)、陰性對照均確立，待測樣品孔的熒光曲線圖見圖2。由圖2可見待測樣品所含的細菌capA基因檢測陰性，PA基因檢測陽性。考慮為capA基因缺失或已敲除的炭疽桿菌弱毒株(疫苗株)。經測序及上報檢測結果后的反饋信息證實，檢測結果完全正確。

圖2 實毒樣品的雙重實時熒光定量PCR檢測曲線

3 討論

炭疽桿菌致病性與其PX01質粒上的保護性抗原基因(PA)和PX02質粒上的莢膜合成相關基因(capA)相關，如果只有其中一種質粒，即為弱毒株或無毒株［6-7］。在發生疫情和突發公共衛生事件中，因預警、控制及應急反應決策的需要，對于炭疽桿菌更需同時檢測PA和capA，以區分是否存在炭疽桿菌并鑒定區分強毒株或弱毒、無毒株［8-9］。因此，建立一種炭疽桿菌的雙重檢測方法具有顯著的針對性和實用性［10-11］。

本研究成功構建了同時含有炭疽桿菌capA基因片段、PA基因片段的重組質粒CapA-PA-PGEM，經測序正確，準確定量后，以此為標準品，建立了雙重實時熒光定量PCR方法。由圖1的熒光曲線可見，兩個體系各自的特異性和工作性能良好，互相間無干擾;當capA基因為每反應5拷貝數、PA基因為每反應50拷貝數時，用本方法仍然能夠檢出。同時檢測時FAM通道(capA)信號明顯比JOE通道(PA)信號強，除引物探針性能外，也有可能是報告熒光的差異(目前FAM是使用最廣泛和穩定的熒光基團)或基因表達豐度的問題，但并不影響實際應用［12］。對枯草芽孢桿菌、枸櫞酸桿菌、鼠疫桿菌核酸、嗜肺軍團菌、各型沙門菌、志賀菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等進行檢測，均為陰性，本法特異性較好。除上述實驗室考驗外，本研究建立的方法還在實戰中得到檢驗，在某重大保障活動中，對實毒實樣(白色粉末)進行檢測時準確鑒定出混入的少量炭疽桿菌弱毒株［13］。

本研究建立了能同時檢測炭疽桿菌PA基因、capA基因的雙重實時熒光 PCR的技術，在具有快速準確、高靈敏度的特點同時，可以實現一管多檢，省時省力，極大地提高了檢測速度和效率，對于應對突發傳染病疫情及突發公共衛生事件應急處置的早期檢測，反生物恐怖襲擊預警等都具有重要的意義。

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