環(huán)三磷腈對羥基苯甲醛芳胺衍生物的合成及分子識別功能

盧艷飛，宋婷婷，劉巨濤，孫振剛

(1.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116605;2.遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連116029)

化學生物學作為一門新興的前沿性交叉學科，其核心是運用生物活性小分子作為化學探針達到對生物通路調(diào)控的目的［1］。此外，合成和篩選生物活性小分子，并從生物活性小分子出發(fā)尋找它們的生物靶分子，進而研究活性小分子與生物靶分子的分子識別、相互作用和信息傳遞。生命過程的小分子調(diào)控機制［2-3］及發(fā)現(xiàn)新穎藥物也是化學生物學研究的關鍵［4-5］。隨著基因組計劃的全面展開，基因治療已成為一種從根本上治療疾病的新興手段，而磷腈類物質(zhì)因具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒性及相對穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)而被廣泛用于藥物控釋及組織工程等生物醫(yī)用領域［6-9］。

本文以具有獨特結(jié)構的六氯環(huán)三磷腈為基礎原料［10-11］，通過與希夫堿基化合物反應，制得環(huán)三磷腈希夫堿基枝化衍生物。以衍生物為活性小分子，探索其對信號分子激活劑磷酸吡哆醛的識別功能，致力于研究調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通道的生物活性物質(zhì)的分子識別和作用機制，為生物小分子與細胞內(nèi)的各種蛋白酶相互作用，激活或抑制各種信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應，控制各種細胞功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

核磁共振譜儀(Varian UNITY-plus 300 Hz，美國Varian公司)，傅立葉變換紅外光譜儀(IR Prestige 21，日本島津儀器公司)，UV 5500 PC紫外光譜儀(上海METASH儀器有限公司)。環(huán)三磷腈、2，2-二羥基聯(lián)苯、二氯甲烷、丙酮、對羥基苯甲醛、芐胺、苯胺、磷酸吡哆醛均為分析純。

1.2 合成實驗

1.2.1 2-聯(lián)苯酚氧基 -4，4’，6，6’- 四氯環(huán)三磷腈合成

稱取六氯環(huán)三磷腈5.006 7 g(14.4 mmol)，加入無水碳酸鉀10.0 g及丙酮150 mL。加熱至回流后，滴加溶有2.681 6 g(14.4 mmol)2，2’-聯(lián)苯二酚的50 mL丙酮溶液，繼續(xù)反應3 h，除去丙酮后，以二氯甲烷萃取，萃取液揮發(fā)至干，用乙醇重結(jié)晶后得白色固體(1)4.979 6 g，產(chǎn)率為75.02%。合成路線如下:

1.2.2 2，4-二聯(lián)苯酚氧基-6，6’-二氯環(huán)三磷腈合成

稱取六氯環(huán)三磷腈5.006 3 g(14.4 mmol)，加入無水碳酸鉀10.0 g及丙酮150 mL。加熱至回流后，滴加溶有5.362 7 g(28.8 mmol)2，2’-聯(lián)苯二酚的50 mL丙酮溶液，繼續(xù)反應3 h，除去丙酮后，以二氯甲烷萃取，萃取液揮發(fā)至干，用乙醇重結(jié)晶后得白色固體(2)6.660 5 g，產(chǎn)率為80.55%。合成路線如下:

1.2.3 對羥基苯甲醛苯胺希夫堿合成

參照文獻［12］合成方法，稱取對羥基苯甲醛3.6636 g(30 mmol)，加入苯胺2.70 mL(30 mmol)及無水乙醇50 mL，加熱回流2 h，濃縮至干，用乙醇重結(jié)晶后得白色固體(3)4.289 4 g，產(chǎn)率為72.49%。合成路線如下:

1.2.4 對羥基苯甲醛芐胺希夫堿合成

按照化合物(3)合成方法合成對羥基苯甲醛芐胺希夫堿，得白色固體(4)5.744 9 g，產(chǎn)率為90.65%。合成路線如下:

1.2.5 環(huán)三磷腈對羥基苯甲醛芳胺衍生物合成

稱取化合物(1)0.921 8 g(2 mmol)，以100 mL丙酮溶解后，加入無水碳酸鉀4 g，滴加溶有1.578 0 g(8 mmol)對羥基苯甲醛苯胺希夫堿的40 mL丙酮溶液(20 min滴加)，繼續(xù)回流4 h，旋蒸除去丙酮，用二氯甲烷索氏提取3 h，提取液抽濾后得黃色溶液，自然放置揮發(fā)得到2-聯(lián)苯酚氧基環(huán)三磷腈-4，4’，6，6’-四對羥基苯甲醛苯胺，用乙醇重結(jié)晶后得黃色固體(5)1.715 7 g，產(chǎn)率為77.71%。合成路線如下:

按照上述方法分別合成了2，4-二聯(lián)苯酚氧基環(huán)三磷腈-6，6’-二對羥基苯甲醛苯胺得黃色固體(6)1.301 7 g，產(chǎn)率為72.66%;2-聯(lián)苯酚氧基環(huán)三磷腈-4，4’，6，6’-四對羥基苯甲醛芐胺，得黃色固體(7)0.861 7 g，產(chǎn)率為74.28%及2，4-二聯(lián)苯酚氧基環(huán)三磷腈-6，6’-二對羥基苯甲醛苯胺，得黃色固體(8)0.634 7 g，產(chǎn)率為65.71%。合成路線分別如下:

1.3 環(huán)三磷腈對羥基苯甲醛芳胺衍生物對磷酸吡哆醛的識別功能

實驗過程中以環(huán)三磷腈對羥基苯甲醛的4種芳胺衍生物為工具，分別對磷酸吡哆醛進行了識別功能研究，僅以化合物(5)為例。

準確稱取化合物(5)0.020 7 g，于25 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容得濃度為0.75×10-3mol·L-1的儲備液，量取0.50 mL化合物(5)儲備液用二氯甲烷定容至10 mL，得稀釋液，濃度為0.38×10-4mol·L-1。

準確稱取磷酸吡哆醛0.001 2 g，于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，得濃度為0.50×10-3mol·L-1儲備液，量取5 mL用乙醇定容至10 mL，得稀釋液，濃度為0.25×10-3mol·L。

準確量取稀釋后的化合物(5)儲備液1.00 mL 5份，分別加入稀釋后的磷酸吡哆醛儲備液0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL 得待測溶液。以二氯甲烷-乙醇混合溶液作空白，常溫下利用紫外光譜儀測定最大吸收波長處的吸光度，研究衍生物對磷酸吡哆醛的識別功能，并考察在磷酸吡哆醛作用下衍生物紫外特征吸收的變化規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 譜學性質(zhì)

化合物(1):紅外光譜可見1 230.58，1 192.01，1 165.00，1 159.22 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 278.81 cm-1P=N 特征吸收;1 500.62，1 475.54，1 436.97 cm-1Ar特征吸收;1 093.64 cm-1P-Cl特征吸收。1H NMR 可見 7.258，7.341，7.438，7.511苯 H特征吸收;13C NMR可見122.033，126.362，128.778，130.005，147.936 ppm 苯 C 特征吸收。

化合物(2):紅外光譜可見1 211.30，1 176.58，1 170.79 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 267.23 cm-1P=N 特征吸收;1 500.62，1 477.47，1 438.90 cm-1Ar特征吸收;1 093.64 cm-1P-Cl特征吸收。1H NMR可見7.260，7.320，7.442，7.555 ppm苯 H特 征 吸 收。13C NMR 可 見 122.033，126.766，128.503，130.142，147.563 ppm芳C特征吸收。

化合物(3):紅外光譜可見3 427.51cm-1酚羥基特征吸收;1 579.71 cm-1C=N特征吸收;1 386.82，1 442.75，1 514.12 cm-1苯環(huán)對位取代C-H特征吸收。1H NMR可見10.13 ppm為羥基中H特征吸收;8.451 ppm為-CH=N-中H的特征吸收;7.788，7.767 ppm為芳醛中苯H特征吸收;7.406～6.878 ppm為芳胺中苯H特征吸收。13C NMR可見161.334 ppm為-CH=N-中C的特征吸收;160.679，152.684，131.384，129.814，128.199，126.004，121.561，116.539 ppm 為苯環(huán)上C特征吸收。

化合物(4):紅外光譜可見3 446.79cm-1酚羥基的特征吸收;1 604.77 cm-1C=N特征吸收;1 394.53，1 454.33，1 519.91 cm-1苯環(huán)對位取代C-H特征吸收。1H NMR可見9.919 ppm為羥基中H特征吸收8.351 ppm為-CH=N-中H特征吸收;7.623～6.815 ppm為苯H特征吸收;4.697 ppm為-CH2中H特征吸收。13C NMR可見161.791 ppm為-CH=N-中C特征吸收;160.671，140.704，130.485，128.984，128.541，127.353，116.196 ppm為苯環(huán)上 C特征吸收;64.663 ppm為-CH2中C特征吸收。

化合物(5):紅外光譜可見1 093.64，1 178.57，1 228.66 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 269.16 cm-1P=N特征吸收;1 652.91 cm-1C=N特征吸收;1 436.97，1 458.19，1 506.41 cm-1Ar 特征吸收。1H NMR可見 8.680，8.621，8.525，8.425 ppm 為 -CH=N-中H特征吸收;8.139～6.436 ppm為苯H的特征吸收。13C NMR可見151.784 ppm為-CH=N-中 C 特征吸收;143.645，126.048，123.091，122.718，122.360，121.636，121.186，113.245，108.322，106.272 ppm為苯環(huán)上C特征吸收。

化合物(6):紅外光譜可見1 093.64，1 180.44，1 232.52 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 271.09 cm-1P=N特征吸收;1 635.64 cm-1C=N特征吸收;1 436.97，1 475.55，1 506.41 cm-1Ar特征吸收。1H NMR可見8.466 ppm為-CH=N-中H特征吸收;7.978～7.105 ppm為苯H特征吸收。13C NMR可見159.521 ppm為-CH=N-中C特征吸收;153.378，152.037，148.257，133.663，131.849，131.041，129.418，126.400，122.049，121.866，121.187，116.188.ppm為苯環(huán)上C的特征吸收。

化合物(7):紅外光譜可見1 095.57，1 176.58，1 230.58 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 273.02 cm-1P=N特征吸收;1 635.63 cm-1C=N特征吸收;1 436.97，1 473.62，1 506.41 cm-1Ar特征吸收。1H NMR可見8.615 ppm為-CH=N-中H特征吸收;8.026～7.210 ppm為苯H特征吸收;4.833 ppm為-CH2中H特征吸收。13C-NMR可見154.169 ppm為 -CH=N-中 C特征吸收;154.169，152.973，143.843，139.553，131.947，126.026，123.160，122.665，120.759，119.914，114.030，113.710，113.123，107.865 ppm為苯環(huán)上 C特征吸收;56.378 ppm為-CH2中C特征吸收。

化合物(8):紅外光譜可見1 095.57，1 176.58，1 232.51 cm-1P-O-Ar特征吸收;1 269.16 cm-1P=N特征吸收;1 627.92 cm-1C=N特征吸收;1 436.97，1 475.54，1 500.62 cm-1Ar特征吸收。1H NMR可見8.398 ppm為-CH=N-中H特征吸收;7.842～7.062 ppm為苯H特征吸收;4.830 ppm為-CH2中H特征吸收。13C NMR可見161.205 ppm為-CH=N-中C特征吸收;152.997，152.921，148.219，139.493，133.671，130.371，129.083，128.778，128.618，127.376，122.079，121.690 ppm為苯環(huán)上 C特征吸收;65.303 ppm為-CH2中C特征吸收。

化合物的可能結(jié)構如圖1。

圖1 4種環(huán)三磷腈衍生物的結(jié)構

2.2 磷酸吡哆醛識別功能研究結(jié)果

常溫常壓下，利用紫外光譜研究了衍生物(5)—(8)對磷酸吡哆醛的識別功能，結(jié)果如圖2(注:各圖曲線由下至上的順序與加入磷酸吡哆醛的量由少到多的順序一致)。

圖2 衍生物對磷酸吡哆醛識別的紫外光譜圖

結(jié)果表明，化合物(5)和(7)對磷酸吡哆醛均 有識別功能，且隨著磷酸吡哆醛加入量的逐漸增加，特征吸收強度發(fā)生相應變化，但無明顯的計量關系，這可能與磷酸吡哆醛對衍生物希夫堿基的質(zhì)子化程度有關，而化合物(6)和(8)的識別過程是隨著磷酸吡哆醛加入量的逐漸增加，特征吸收強度逐漸增大，識別作用明顯，這可能與希夫堿基支鏈增多，空間阻礙作用增強，限制了其與磷酸吡哆醛間的鍵合識別作用有關，也提示只有特定結(jié)構類型的衍生物才具有磷酸吡哆醛鍵合識別功能。

衍生物對磷酸吡哆醛識別的劑-效關系如圖3。

圖3 衍生物對磷酸吡哆醛識別的劑-效關系圖

從圖3可知，隨著磷酸吡哆醛濃度的逐漸增大，衍生物(5)和(7)的吸光度發(fā)生不同程度降低，趨勢明顯，但無明顯劑量關系，可能與磷酸吡哆醛對衍生物希夫堿基的質(zhì)子化程度及衍生物的結(jié)構有關;從B、D兩條曲線中可以看出，隨著吡哆醛濃度的增大，吸光度也隨之增大，表明衍生物(6)和(8)對磷酸吡哆醛的識別過程呈明顯計量關系，提示希夫堿基支鏈的多少及衍生物的結(jié)構對磷酸吡哆醛鍵合識別功能有很大影響。

3 結(jié)語

本文以六氯環(huán)三磷腈為起始原料，在不同摩爾的2，2’-聯(lián)苯二酚保護下，得到2種取代環(huán)三磷腈衍生物，分別與希夫堿基化合物反應，成功合成了4種環(huán)三磷腈衍生物。通過紅外、1H NMR和13C NMR等手段表征了環(huán)三磷腈衍生物的結(jié)構，并利用紫外光譜初步研究了衍生物對磷酸吡哆醛的識別功能，探索了環(huán)三磷腈希夫堿基枝化產(chǎn)物的結(jié)構與其信號分子激活劑識別性能之間的關系，為該類物質(zhì)的結(jié)構優(yōu)化及信號分子激活劑活性調(diào)控功能的研究奠定了理論基礎。

［1］CREWS C M，SPLITTGERBER U.Chemical genetics:exploring and con-trolling cellular processes with chemical probes［J］.TIBS，1999，24:317-320.

［2］杜燦屏，劉魯生，張恒.21世紀有機化學發(fā)展戰(zhàn)略［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002.

［3］姜勇，羅深秋.細胞信號轉(zhuǎn)導的分子基礎與功能調(diào)控［M］.北京:科學出版社，2005.

［4］KELLEY S O，BARTON J K.Electron transfer between bases in double helical DNA［J］.Science，1999，283:375-381.

［5］MARTíN T，OBST U，REBEK J J R.Molecular assembly and encapsulation directed by hydrogen-bonding preferences and the filling of space［J］.Science，1998，281:1842-1845.

［6］ANDRIANOV A K，INORG J，ORGANOMET P.Water-soluble polyphosphazenes for biomedical applications［J］.J.Inorg.Organomet.Polym.Mater，2006，16(4):397-406.

［7］ALLCOCK H R，KWON S.An ionically crosslinkable polyphosphazene:poly［bis(carboxylatophenoxy)phosphazene］and its hydrogels and membranes［J］.Macromolecules，1989，22(1):75-79.

［8］ALLCOCK H R，AUSTIN P E ，NEENAN T X ，et al.Polyphosphazenes with etheric side groups:prospective biomedical and solid electrolyte polymers［J］.Macromolecules，1986，19(6):1508-1512.

［9］李非凡，田華雨，陳磊，等.六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)寡聚乙烯亞胺的制備及作為非病毒基因載體研究［J］.高等學校化學學報，2010，31(9):1890-1900.

［10］DEWAR M J S，LUCKEN E A C，WHITEHEAD M A.The structure of the phosphanitrilihalides［J］.Journal of the Chemical Society，1960(2):2423-2429.

［11］VICTOR L，MARTIN P A，AURORA C.Topological analysis of chemical bonding in cyclophosphazenes［J］.Journal of Physical Chemistry A，2001，105(21):5280-5291.

［12］秦大斌，楊海英，雷剛.水楊醛縮鄰苯二胺Schiff堿及其配合物的合成與催化性能［J］.西華師范大學學報:自然科學版，2003，24(4):423-425.