捕食線蟲真菌絲氨酸蛋白酶PII結構的同源模建

楊力權，桑 鵬，李珍貴

（1.大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003;2.云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室,昆明 650091）

捕食線蟲真菌通過菌絲變態形成的各種捕食器官，如收縮性環或非收縮性環、黏性分枝、黏性菌結、黏性菌網等捕食線蟲〔1〕。少孢節叢胞菌是捕食線蟲真菌的代表種類，PII（EC3.4.21）是從少孢節叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）液體培養物中分離出的具備殺線蟲活性的胞外絲氨酸蛋白酶〔2〕。它可以固定線蟲并降解線蟲表皮，具有高效殺線蟲活性，因此被認為是真菌侵染線蟲過程中重要的毒力因子之一。目前，通過基因工程技術已經對PII的基因克隆和異源表達進行了研究；同時，PII的氨基酸序列也已經獲得，對其蛋白酶的物理化學特征、反應優化條件、底物特異性等也進行了一定研究〔3〕。但由于其晶體結構未被測定，因此對其催化性能及機理，以及結構和功能關系還未進行廣泛深入的研究。本文通過同源模建技術構建蛋白酶PII的三維結構模型并對其結構進行分析，為在分子水平上研究殺線蟲機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 原理 同源模建〔4〕是基于序列-結構相似性原則，通過模板蛋白構建待測蛋白質的三維結構模型。當蛋白質序列的一致性大于30%，便可以利用模板蛋白的結構來建立靶蛋白的三維結構〔4〕。同源模建的原理基于兩點：蛋白質的結構由其氨基酸序列唯一決定；蛋白質的結構在進化中更穩定，結構變化比序列變化要慢得多，因此序列上的相似性導致同源蛋白具有相似的三維結構，并且進化上距離較遠的相關序列仍可折疊成相似的結構。

1.2 序列比對和模板蛋白 在UniProtKB數據庫中獲得PII的序列，去掉信號肽和先導肽殘基，得到包含286個氨基酸殘基的成熟PII序列。在Biology Workbench生物平臺中〔5-6〕，以成熟PII的序列作為查詢序列，使用PSI-BLAST〔6〕進行序列搜尋和比對，得到的最接近序列為PDB編號3F7M的序列。PII與3F7M的序列比對結果顯示，序列一致性達到45%（Identities=131/287（45%），Positives=177/287（61%），Gaps=16/287（5%））。3F7M〔7〕是由刀孢輪枝菌分泌出來的體壁降解絲氨酸蛋白酶Ver112（EC3.4.21），包含279個氨基酸。由于PII與Ver112具有較好的序列一致性，選取Ver112的晶體結構作為模板蛋白。

1.3 同源模建及能量優化 本文采用專業同源模建軟件Modeller9.11〔8〕來構建蛋白酶PII結構模型。使用自行編寫的Modeller腳本文件“align2d.py”對靶序列PII與模板序列3F7M進行序列比對，比對后進行手工調整使兩者的保守位置盡量對齊，以保證模建結構的準確。隨后用自行編寫的Modeller腳本文件“model-single.py”，生成5個PII結構模型，采用模擬退火算法對結構進行能量優化，采用分子概率密度函數molpdf對模型進行評估。

2 結果和討論

2.1 模建結構模型的評估 把能量最小化后的PII分子結構模型用Procheck〔9〕進行模建結構的評價。得到了相應的評價結果和Ramachandran圖（見圖1）。結果顯示，其中86.8%的氨基酸處于最適區，9.9%處于較合適區，2.5%處于可接受區，0.8%處于不合理區。由此可見，99.2%的氨基酸殘基分布在Ramachandran圖的二面角合理區域，也就是說99.2%的氨基酸構象是可以接受的，說明模建的結構合理。

圖1 PII模建結構模型的Ramachandran圖

2.2 蛋白酶PII結構模型分析 蛋白酶PII的結構模型包含6個α螺旋，2個3/10螺旋，1個7鏈平行β片層和1個雙鏈反平行片層，催化三聚體由Asp 41，His77和Ser230組成（見圖2）。兩段氨基酸殘基108-111和136-139組成了PII的底物結合區域，在Ver112晶體結構中存在兩對二硫鍵，而在PII結構模型中沒有發現二硫鍵存在。

圖2 蛋白酶PII的結構模型

整體上看，蛋白酶PII的結構模型具有枯草桿菌絲氨酸蛋白酶特有的α/β腳手架折疊模式；具有完全保守的催化三聚體和氧負離子孔結構組織，以及同樣具有上下兩部分α螺旋與中間的7股平行β折疊片組成的三明治結構。對于像絲氨酸蛋白酶這類的蛋白酶，一般都具有一個堅固的球狀折疊構型，其中多種因素共同維系和影響著結構的穩固，如二硫鍵、范德華力、疏水作用力、氫鍵、鹽鍵、芳香環堆積和鈣離子的結合等。整體結構的穩定性保證其不易被自身和其它蛋白酶水解，但在結合位點等局部區域又必須具備一定的構象柔性，以保證其催化功能的發揮。結合位點的構象柔性越大，其催化活性越強，而二硫鍵在保證整體結構穩定性和局部構象柔性上都有重要作用〔10〕。實驗測定數據表明，Ver112比PII具備更強的殺線蟲活性。結合兩者的三維結構，由于PII不具備二硫鍵，將可能導致其全局結構穩定性和結合位點的構象柔性低于Ver112，從而影響其殺線蟲活性，這也從結構的層面解釋了Ver112比PII具備更強的殺線蟲活性。本文的研究結果將為進一步深入研究PII的結構和功能之間的關系奠定結構基礎。

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