藿香正氣膠囊微生物限度檢查法驗證

胡 林，翁永京，萬小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

藿香正氣膠囊微生物限度檢查法驗證

胡 林，翁永京，萬小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

為建立藿香正氣膠囊微生物限度檢查驗證方法，采用多種陽性菌作為對照菌，采用回收率試驗測定其抑菌成分對微生物限度檢查的影響.根據回收率試驗結果，藿香正氣膠囊抑菌成分對微生物限度檢查影響較大，通過系統性設置試驗，表明薄膜過濾法、離心沉淀薄膜過濾法能消除其影響，但薄膜過濾法中枯草芽孢桿菌回收率相對較低，抑菌成分消除不徹底，而離心沉淀集菌薄膜過濾法能完全、徹底消除其抑菌作用.

微生物限度檢查;抑菌成分;薄膜過濾;驗證

0 引言

藿香正氣膠囊是一種具有解表化濕，理氣和中功效的，含有廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術、陳皮、厚樸、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮等成分的中成藥，常用于外感風寒、內傷濕滯、頭痛昏重、胸隔痞悶、脘腹脹痛和嘔吐泄瀉等癥的治療.由于本品為含有多種抑菌成分的中藥材制劑［1-17］，按《藥典》規定，含抑菌成分的中成藥的微生物限度檢查［20-21］必須在消除供試液抑菌活性后，再按規定的方法進行檢查.同時，還需對所采用檢測方法進行驗證試驗，以確認供試品的抑菌活性和保證測定方法的可靠性.據此，本研究對藿香正氣膠囊微生物限度檢查法進行方法驗證，以評價本品微生物限度檢查方法的可行性，規范微生物限度檢查方法，進而提供產品質量控制依據.

1 儀器與材料

1.1 儀器

實驗所用的儀器包括:生化培養箱、顯微鏡、立式電熱蒸汽消毒器、天平、ZF-1型紫外燈、電熱鼓風干燥箱、恒溫水浴鍋、平皿(直徑90 mm)、接種針、振蕩器、酒精燈、離心機等.

1.2 樣品

實驗所用的樣品為藿香正氣膠囊，由四川泰華堂制藥有限公司生產(批號為，110201、110601、120301).

1.3 培養基

實驗中，營養瓊脂培養基用于細菌計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌及酵母菌計數，膽鹽乳糖培養基用于大腸埃希菌培養.

1.4 實驗菌株

實驗所有菌株包括:大腸埃希菌 CMCC(B)(44102)、金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)(63501)、白色念珠菌 CMCC(F)(98001)和黑曲霉CMCC(F)(98003)，所有菌株均由中國藥品生物制品檢定所提供.

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

按照文獻［20］中“細菌、霉菌及酵母菌項下計數方法的驗證”方法對本品進行計數方法的驗證，同時參考國家藥典委員會網上公布之相關方法.

2.1.1 常規法.

為明確本品驗證的過程，確保驗證不受常規法分析的干擾，故做常規法的驗證.

1)對照用菌液的制備.取經37℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋制成每1 mL中含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經25℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物，加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL中含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經20～25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗一下，用帶有棉花的球形吸管取出菌液至無菌試管內，加0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL中含孢子數為50～100 cfu的孢子懸液，備用.

2)供試液的制備.無菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖后靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

3)回收率測定.

①試驗組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，同時加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養，每株試驗菌平行制備2個平皿，記錄其菌數，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每種計數用的培養基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取稀釋劑1 mL，加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養，每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

4)結果.細菌培養48 h，逐日點計菌落數;霉菌、酵母菌培養72 h，逐日點計菌落數.實驗結果表明，實驗中所有枯草芽孢桿菌回收率均未達到70%，故考慮采用培養基稀釋法進行驗證.

2.1.2 培養基稀釋法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規法.

2)回收率測定.

①試驗組.分別取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，同時加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養.每株試驗菌平行制備2個平皿，記錄其菌數，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每種計數用的培養基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取稀釋液0.2 mL，加入50～100 cfu試驗菌株，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，按試驗組方法操作全過程.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

3)結果.細菌培養48 h，逐日點計菌落數;霉菌、酵母菌培養72 h，逐日點計菌落數.實驗結果表明，實驗組枯草芽孢桿菌回收率仍未達到70%，故考慮采用薄膜過濾法進行驗證.

2.1.3 薄膜過濾法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規法.

2)回收率試驗.

①試驗組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過濾器中，過濾.用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養基上培養.每種計數用的培養基各制備2個平板，測定回收率.

②供試液對照組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過濾器中，過濾.用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養基上培養.每種計數用的培養基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu/mL試驗菌株加加入無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取緩沖液100 mL和50～100 cfu試驗菌株加入薄膜過濾器中，過濾，后取膜貼于瓊脂平板培養基上培養.每株試驗菌平行制備2個平板.

⑤培養和計數.細菌培養48 h，逐日點計菌落數，一般以48 h的菌落數報告;霉菌、酵母菌培養72 h，逐日點計菌落數，一般以72 h的菌落數報告.點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌落報告規則報告菌落.

3)結果.細菌培養48 h，逐日點計菌落數;霉菌、酵母菌培養72 h，逐日點計菌落數.結果見表1、表2.

表1、2結果表明，以上各次實驗回收率均在70%以上，表2結果表明，以上各次實驗回收率均在70%以上，可采用薄膜過濾法進行驗證.但該方法中枯草芽孢桿菌回收率有待進一步提升.為保證徹底消除產品中抑菌成分，同時保證回收率實驗穩定、可行，故考慮采用離心沉淀集菌薄膜過濾法進行驗證.2.1.4 離心沉淀集菌薄膜過濾法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規法.

表1 薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率)結果表

表2 薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率)結果表

2)回收率測定.

①試驗組.吸取供試液10 mL，于已滅菌的具塞離心管內，以500 r/min離心5 min，取上清液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過濾器中，過濾.用 pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗，100 mL/次，分別試驗，每膜沖洗3次和5次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養基上培養.每種計數用的培養基各制備2個平板，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液1 mL，用pH值7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過濾器中，過濾.沖冼液100 mL/次，分別實驗，每膜沖洗3次和5次，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養基上培養.每種計數用的培養基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取試驗用稀釋液10 mL，按試驗組供試液制備方法操作全過程.每個菌種計數用的培養基各制備2個平板.

3)結果.細菌培養48 h，逐日點計菌落數;霉菌、酵母菌培養72 h，逐日點計菌落數.結果見表3～表6.

表3 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率試驗)結果表(沖洗液300 mL/膜;n=3)

表4 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率試驗)結果表(沖洗液300 mL/膜)

表5 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率試驗)結果表(沖洗液500 mL/膜;n=3)

表6 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率試驗)結果表(沖洗液500 mL/膜)

表3～6結果表明，以上各次實驗回收率均在80%以上.

實驗驗證結果表明，薄膜過濾法對照菌的回收率均雖然達到70%以上，但該實驗方法中枯草芽孢桿菌回收率相對較低，抑菌成分消除不徹底.離心沉淀集菌薄膜過濾法對照菌的回收率均達到80%以上，徹底消除了抑菌成分.同時，實驗中還發現，該法隨著沖洗量的增加，測定對照菌的回收率反而有下降的趨勢，且實驗過程中易出現濾膜破損等情況，故選擇沖洗液沖洗量為300 mL/膜的離心沉淀集菌薄膜過濾法.

2.2 控制菌檢查法的驗證

按照文獻［20］中“控制菌檢查法的驗證”進行驗證.

2.2.1 供試液的制備.

無菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖，靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

2.2.2 驗證實驗.

1)試驗組.取供試液10 mL至緩沖液100 mL中，混勻.加入薄膜過濾器中，用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入10～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜加入增菌培養基中，按照相應控制菌檢查法檢查.

2)陰性菌對照組.取10～100 cfu金黃色葡萄球菌加入增菌培養基中，按照相應控制菌檢查法檢查，作為大腸埃希菌陰性對照.

驗證實驗結果如表7所示.

表7 驗證實驗結果表(n=3)

表7數據表明，以上各次實驗驗證的控制菌檢查方法專屬性較強、方法可行.

3 討論

中藥成分復雜，許多成分都有不同程度的抑菌作用，因而有必要根據各個品種、各個企業具體生產工藝，通過不同方法驗證實驗確立適宜的微生物限度檢驗方法.

本研究中的藿香正氣膠囊，其藥材品種較多，各藥材抑菌成分復雜，且相互交替影響，故對微生物限度驗證方法的選用具有典型意義.

本研究對藿香正氣膠囊制劑生產過程中使用醇沉工藝、大孔樹脂工藝的品種的微生物驗證做了初步的研究，驗證了薄膜過濾法、離心沉淀集菌薄膜過濾法等方法.實驗發現，離心沉淀集菌薄膜過濾法以低速500 r/min離心，再以高速3 000 r/min離心集菌較為適宜，沖洗量達到300 mL時可消除抑菌作用，但隨著沖洗量增加，易出現濾膜破損等不易控制情況.

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Validation of Microbial Limit Test of Huoxiangzhengqi Capsule

HU Lin，WENG Yongjin，WANG Xiaoling，HUANG Lihong
(Sichuan Taihuatang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guanghan 618300，China)

A variety of Gram-positive bacteria are used as the control bacteria.The recovery test determines the impact of antifungal composition on microbial limit tests.According to the results of the recovery test，Huoxiangzhengqi capsule antifungal composition has great effect on the microbial limit test.Through the systematic set to test，the results show that the membrane filtration，centrifugation and membrane filtration method can eliminate its influence.But in the membrane filtration method，bacillus subtilis recovery rate is relatively low and antibacterial ingredients can＇t be eliminated thoroughly.The centrifugal sedimentation and membrane filtration method can eliminate the antimicrobial effect completely and thoroughly.

microbial limit test;antifungal composition;membrane filtration;verification

R284

A

1004-5422(2013)03-0224-05

2013-07-05.

胡 林(1974—)，男，工程師，從事中藥新制劑研究.