手工制備冰凍解凍紅細胞方法與操作要點

王惟 李丹 劉微

隨著成分輸血的開展，冰凍解凍去甘油紅細胞是用甘油作為冷凍劑低溫冰凍保存紅細胞制劑的一種方法，是在緊急情況下，能夠及時搶救Rh陰性的患者，近年來臨床應用受到重視，它是一種低溫保存紅細胞很有效的方法［1］。早在60年代，就已建立了冰凍紅細胞低溫保存技術，因為溫度較低的狀態下，紅細胞代謝會逐漸降低，或者細胞代謝活動停止。這樣紅細胞能量的消耗也降低，紅細胞的一些代謝產物也會隨之降低，使紅細胞處在休眠狀態。冷凍血是其它制劑所不能替代的制劑，長達十年的保存期［2］。使Rh陰性血的來源得到保障。為患者搶救爭取了保貴時間。目前紅細胞冷凍保護劑應用的是復方甘油溶液。由于甘油滲透壓較高，人體輸入過量甘油會造成細胞溶血，給患者造成極大損害。所以為了更好提高冰凍解凍去甘油紅細胞的質量，作者在制備時采用手洗梯度洗滌法來制備，在紅細胞制備、保存、解凍洗滌過程中積累一些經驗，現和大家分享一下。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 57%復方甘油溶液、9%氯化鈉溶液、三珠冷凍袋、無菌四聯袋(北京博德桑特輸采血器材科技開發中心)、羥乙基淀粉溶液(濟南三九益民制藥公司)、0.9%生理鹽水(吉林康乃爾公司)、振蕩器(HY-4金壇市)、無菌接駁機(SC-203A泰爾)、恒溫水浴箱(余姚市東方電工儀器廠)、-80℃速凍冰箱(三洋)、離心機(賀利氏6000I)。

1.2 冰凍紅細胞制備方法 加入甘油，將保存期6d內的全血或紅細胞懸液離心，2200 r/min，25 min，去除上清后，將紅細胞用無菌接駁機與三珠袋相接，并轉移至三珠袋中加甘油，動作一定要輕柔，避免對紅細胞造成人為損傷。200 ml紅細胞需加甘油160 ml，加甘油滴速必須控制，先慢后快，前5 min甘油滴速為40滴/min左右，5 min后甘油滴速可以控制為80滴/min，20 min滴加完畢。振蕩器的頻率為60次/min，振幅為5 cm。甘油化的紅細胞盡量減少人為移動，需要在室溫靜止30 min，30 min后送-80℃速凍冰箱速凍待用，保存一個月以上方可應用。

1.3 洗脫甘油 取出保存在-80℃速凍冰箱內的冰凍紅細胞，在37～42℃水浴箱內融化，融化時間為每袋4～5 min，水浴箱內的水要沒過血袋，融化完成，取出在室溫下靜止5 min，用無菌接駁機連接空袋，在4℃條件下，2300r/min離心8min后去除上清，然后用無菌接駁機與輸血器下端連接，輸血器上端連接9%NaCl溶液(80 ml)，滴速先慢后快，前2 min滴速為20～30滴，2 min后滴速調至50～60滴/min，7 min加完。靜止5 min后，加入羥乙基淀粉溶液100 ml，滴速控制在40～50滴/min，靜止5 min后，再加入0.9%氯化鈉溶液50 ml后，開始離心，2300轉8 min去除上清后，加入0.9%氯化鈉溶液150 ml，勻速加入，60～80滴/min。以上在往冰凍紅細胞加入溶液時均需在振蕩下完成，振蕩器的頻率為60次/min，振幅為5 cm。連續洗滌三次，制備成冰凍解凍去甘油紅細胞。

1.4 在制備過程中加甘油后不同放置時間和洗脫時不同離心力對產品質量有較大影響，按照這兩項條件不同將制備的產品分A組和B組。

1.5 質量控制標準 上清血紅蛋白不超過1 g/L;殘余甘油含量在10 g/L;紅細胞回收率 ＞80%;體外溶血實驗≤50%［3］。

2 結果

2.1 甘油化時紅細胞加甘油后不同放置時間，A組15 min，B組30 min，檢測甘油殘留量，A組甘油殘留量:7.85±0.65(g/L);B組甘油殘留量:(4.49±0.92)(g/L)。每組各8袋。兩組相比P＜0.05，差異有統計學意義。

2.2 在洗脫甘油過程中，適當的離心力既能很好地去除甘油，又能減少重離心對紅細胞的破壞，作者采用不同離心力制備冰凍紅細胞后檢測冰凍紅細胞各項參數，做如下比較，A組2600轉/min，B組3300轉/min，見表1。

表1 洗脫甘油過程中兩種離心力的對比

3 討論

冰凍解凍去甘油紅細胞主要用于Rh陰性血的長期保存，以及為自身輸血創造條件［4］。能極大緩解供需緊張的矛盾。自從本站開展冰凍解凍去甘油紅細胞技術以來，為臨床患者提供很大方便。但是在手工制備過程中，一些微小的細節應該引起制備者的注意。①滴速問題，先慢后快的滴速對紅細胞膜的刺激作用會變小一些，讓紅細胞膜內外的環境在逐漸變化，以免因為滲透壓作用造成對紅細胞膜的損害。②加入甘油后的成品，三珠袋內的空氣一定要排凈，因為血袋內微小的空氣氣泡聚集在一起形成大氣泡，會破壞紅細胞膜，極易造成溶血。③在-80℃速凍冰箱取出的冰凍紅細胞，盡量減少在室溫的放置時間，在加入甘油后要保證靜止時間。④離心問題，經過多次選擇離心力，試驗證明，離心力大小很影響冰凍紅細胞的質量，過大離心力會對紅細胞造成不可逆轉的損傷。對于加入甘油冰凍保存長達十年紅細胞來說，保護紅細胞膜十分重要。⑤振蕩器的振幅和頻率也很重要，必須保持在有效范圍內，振幅5 cm，頻率60次/min。⑥臨床應用冰凍解凍去甘油紅細胞經過去甘油的反復洗滌，去除了細胞代謝產物，以及大部分的白細胞、血小板、血漿蛋白，能大大減少輸血反應。能為臨床患者提供高質量的冷凍血。

［1］ 邱艷．全血成分血質量要求與血液標準化．北京:中國標準出版社，2002:72-73．

［2］ 王培華．輸血技術學．北京:人民衛生出版社，2002:70-73．

［3］ 中華人民共和國國家標準．全血及成分血質量要求GB18469-2001．

［4］ 安萬新，于衛建．輸血技術學．北京:科學技術文獻出版社，2010:167．