不同保存溫度對布氏菌病活疫苗(S2株）細菌存活的影響

張讀樸，彭飛，烏斯滿江，黃炯,2，張玉紅，劉淑梅，趙海源，王洪巧

（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032；2 新疆畜牧科學院獸醫研究所 新疆烏魯木齊 830000）

不同保存溫度對布氏菌病活疫苗(S2株）細菌存活的影響

張讀樸1，彭飛1，烏斯滿江1，黃炯1,2，張玉紅1，劉淑梅1，趙海源1，王洪巧1

（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032；2 新疆畜牧科學院獸醫研究所 新疆烏魯木齊 830000）

《中華人民共和國獸用生物制品規程》規定布氏菌病活疫苗貯藏條件為2℃～8℃，有效期為一年。但在疫苗檢驗過程中，發現保存在2℃～8℃條件下的布氏菌病活疫苗活菌數下降的幅度較大，造成活菌數時有不達標的情況。為了保證疫苗在一年有效期內的活菌數量，常常采用增大附加量（計算頭份時一般不少于30%的附加量）或低溫冷凍條件保存（-15℃以下）的方法。考慮到疫苗的安全性和成本，增大附加量并不是可采用的好方法，低溫存放卻易于做到。為了驗證2℃～8℃保存和-15℃以下低溫冷凍保存的效果，本研究對比了3批布氏菌病活疫苗（S2株）在不同溫度條件保存對細菌存活的影響。

一、材料與方法

1.疫苗。本公司生產的布氏菌病活疫苗（S2株），批號分別為2010004批、2012006批和2012007批。

2.培養基。胰蛋白眎瓊脂平板、蛋白胨水。

3.試驗方法。以保存1月為周期，每批取2℃～8℃和-15℃保存的疫苗各3瓶，每瓶加適量蛋白胨水充分溶解均勻，然后用蛋白胨水10倍系列稀釋至10-9，取0.1ml滴胰蛋白眎瓊脂平板3個，37℃培養72～96 h數平板上的菌落數，3個平板上菌落數相加除以3乘以疫苗瓶加量（ml）即為每瓶活菌數（CFU）。3瓶活菌數（CFU）平均即為當月保存后的細菌活菌數（CFU）。疫苗剛生產出活菌計數所得活菌數（CFU）即0個月為計算活菌率的基數，計算細菌存活率。

4.統計分析。使用統計學分析軟件Prism 5.0，對同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率進行配對數據的t檢驗，對同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率進行單因素方差分析和Tukey's 多重比較。

二、結果

1.實驗結果。通過對3批布氏菌病活疫苗（S2株）分別保存在2℃～8℃和-15℃的疫苗1年12次的活菌計數檢測，顯示在2℃～8℃條件下保存的疫苗，3批疫苗從第3個月起，活細菌數均明顯下降，存活率在57.9～69.6%之間；至第12個月時存活率已經降至約36.37～48.18%之間。在-15℃以下條件保存的疫苗，在12個月的檢測過程中，只有2010004批細菌存活率最低，為60.29%，2012006批在80%以上，2012007批在75%以上。各批細菌活菌計數結果見表略，存活率變化情況見圖1。

2.統計分析結果。使用統計學分析軟件Prism 5.0，對同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率，以及對同一保存溫度不同批次疫苗的菌存率進行統計分析。

三、討論

由計數結果和折線圖可見，2℃～8℃和-15℃保存的3批布氏菌病活疫苗（S2株），活菌率后者均明顯優于前者。2010004批疫苗保存1年后菌存率2～8℃為36.27%，-15℃為60.29%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P ＜0.01），且后者比前者高24.02%；2012006批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃為44.63%，-15℃為84.36%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P＜0.01），且后者比前者高39.73%；2012007批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃為48.18%，-15℃為89.63%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P＜0.01），且后者比前者高41.45%。通過對比分析顯示，三批布氏菌病活疫苗（S2株）的活菌率2℃～8℃保存的與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P ＜0.01）。

2012006、2012007兩 批疫苗在1年的菌存率檢測中均比2010004批疫苗高，其中，2010004批疫苗2℃～8℃保存的菌存率與2012006批疫苗差異性顯著（P＜ 0.05），與 2012007批疫苗差異性極顯著（P＜0.01）；2010004批疫苗-15℃保存的菌存率與2012006、2012007批疫苗均差異性極顯著（P＜0.01）。出現這種情況，可能是制造疫苗的批間差異，前兩批疫苗的菌液收獲時機比較合適，細菌處于生長的對數期或穩定前期階段，細菌比較健壯（幼齡和老齡都極易死亡）。掌握好菌液收獲時間很重要，既要收獲的細菌活力好，又要活菌數高。在生物制品生產過程中，一般在對數生長期收獲菌液。細菌的形態、革蘭氏染色反應應以對數生長期到靜止期中期的細菌為標準。

有文章報道，布魯氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率為78.5～82.3%。 布魯氏菌病活疫苗（S19株）保存一年活菌率為82.54～82.64%。本次試驗證實布氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率僅為36.27%～48.18%，遠低于報道的78.5～82.3%的水平。

以往通氣生產布氏菌病活疫苗的收獲菌液活菌數只有幾百億CFU/ml，個別的能達到1000億CFU以上/ml，牛種更低一些。隨著技術的進步，設備裝備水平的提高，培養基質量的改進，生產人員經驗的積累，反應罐布氏菌病活疫苗（S2株）菌液通氣生產細菌增殖水平顯著提高，據筆者粗略統計，本公司2010年度生產的37批布氏菌病活疫苗（S2株）菌液活菌數平均為717億CFU/ml；2011年度49批活菌數平均為1328億CFU/ml；2012年度9批活菌數平均為1164億CFU/ml。細菌生長的好，繁殖的快有時也會死亡的快，筆者在做牛出敗疫苗檢驗時，發現培養菌種的培養基中添加血清時，細菌生長的好，活菌數也很高，但存放一定時間后細菌死亡的很快。布氏菌病活疫苗（S2株）是否也有這方面的原因，還需證實。

圖1 三批布氏菌病活疫苗（S2株）不同保存溫度菌存率

表2 同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比較分析

表3 同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比較分析

影響疫苗質量的因素很多，如細菌種子的質量、培養基的質量、培養溫度、菌液培養時加糖量的多少、通氣量的大小、培養過程PH值的變化、菌液收獲時間、菌液存放時間、保護劑質量、凍干曲線等，哪個環節有問題都會對產品造成影響。各個工序都應該認真研究總結，探索最佳條件，以期生產出質量過硬的產品。

根據細菌存活的生物學特性，低溫可以延緩微生物死亡，例如牛瘟兔化弱毒疫苗的新鮮淋脾毒在0℃～4℃只能保存14 d，而在-10℃～-15℃就可保存3個月；豬瘟兔化弱毒疫苗的新鮮脾淋在0℃～4℃只能保存14 d，而在-15℃則可保存6個月。本次研究結果也證實：-15℃保存明顯優于2℃～8℃保存，-15℃保存對保證產品質量起著非常重要的作用，建議修改布氏菌病活疫苗貯藏的規定，將2℃～8℃貯藏調整為-15℃以下貯藏。

（略）