葡萄糖為碳源的EBPR長期運行效果及聚磷菌的富集培養

彭永臻 薛桂松 苗志加 翁冬晨

(北京工業大學北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室，北京 100124)

葡萄糖為碳源的EBPR長期運行效果及聚磷菌的富集培養

彭永臻 薛桂松 苗志加 翁冬晨

(北京工業大學北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室，北京 100124)

摘 要:研究了連續運行364 d以葡萄糖為碳源的強化生物除磷(EBPR)系統，比較了3個不同運行階段典型周期的運行狀況，考察了厭氧段聚磷菌(PAOs)對有機底物的貯存轉化，運用FISH技術分析了系統菌群結構變化.結果表明:隨著運行時間的增加PAOs富集程度增高，第180天后反應器最高厭氧釋磷量達到80 mg/L，出水磷濃度小于1 mg/L，以葡萄糖為碳源的EBPR系統可以長期高效穩定運行;與第1和第2階段相比，第3階段典型周期效果最佳，其厭氧釋磷量達到79 mg/L，PO3－4-P去除率達到97.2%;葡萄糖先被發酵細菌分解為揮發性脂肪酸(VFA)，PAOs吸收VFA合成聚羥基脂肪酸酯(PHA);熒光原位雜交技術分析發現，PAOs比例不斷升高，第340天時比例為45.5%，說明以葡萄糖為碳源的EBPR系統可以富集高濃度的PAOs.

關鍵詞:強化生物除磷;葡萄糖;揮發性脂肪酸;聚磷菌;聚羥基脂肪酸酯

強化生物除磷系統(EBPR)是目前應用最廣的污水除磷工藝.利用EBPR通過富集培養的聚磷菌(PAOs)厭氧釋磷、好氧吸磷的特性，使磷濃度在好氧段急劇降低，最終通過排放富磷污泥實現除磷.聚磷菌代謝過程中存在多聚磷酸鹽(Poly-P)、糖原(Glycogen)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)3種儲能物質，它們對生物除磷起著非常重要的作用.PAOs在厭氧條件下分解Poly-P而產生能量，同時吸收底物中的有機物合成PHA，好氧條件下分解胞內PHA而產生能量，過量吸磷而合成Poly-P.近年來的研究表明除PAOs外，生物除磷系統中還存在聚糖菌(GAOs).GAOs代謝過程與PAOs相似，在厭氧條件下吸收有機物合成PHA，好氧段分解PHA產能合成糖原，但是并不吸收磷酸鹽，故不具備好氧吸磷能力［1－3］.

目前對強化生物除磷系統的研究大多以乙酸丙酸等揮發性脂肪酸(VFA)為碳源［4］.由于葡萄糖及其高分子聚合物在污水中是普遍存在的，葡萄糖為碳源的EBPR的研究日益受到重視.然而對葡萄糖碳源的EBPR能否長期穩定運行還沒有一致結論.有研究表明葡萄糖可以直接被GAOs吸收利用，而不能被PAOs直接利用，從而影響PAOs成為優勢菌種［4－5］.Cech 等［6］對葡萄糖與乙酸混合碳源的EBPR進行研究，發現GAOs成為優勢菌.Zengin等［4］研究發現葡萄糖為碳源可以實現強化生物除磷，但系統長期運行時不穩定.而Carucci等［3］的研究表明葡萄糖為主要碳源時，GAOs并沒有大量繁殖，并且系統可以長期穩定運行.Oehmen等［2］研究表明，pH 為 7.5 ～8.0，溫度為 20 ℃ 時，有利于PAOs成為優勢菌.本文主要通過嚴格控制DO、pH值、溫度、碳磷比、厭氧時間及污泥齡等條件，探討葡萄糖為碳源的EBPR系統長期運行的穩定性，并對厭氧階段PAOs對有機底物的貯能轉化進行研究，結合熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)對其菌群結構進行分析.

1 試驗材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗采用敞口式SBR反應器，有效容積為8 L，由有機玻璃制成.反應器每天運行4個周期，每周期 6 h，其中進水 6 min，厭氧 2.5 h，好氧 3 h，沉淀15 min，排水5 min，靜置4 min.每周期進水2 L，排水2 L，相應HRT為24 h，SRT為10 d.反應器污泥濃度約為2 500 mg/L，運行水溫為(20±2)℃，pH值為7.2 ～8.0，好氧段DO 濃度為2 mg/L.

1.2 活性污泥與試驗用水

試驗用水采用人工配水，由溶液A和溶液B組成(見表1)，反應器1個周期2 L進水中含溶液A 300 mL 和溶液 B 1.7 L.進水碳磷比為20∶1.

表1 穩定運行時期配水成分

微量金屬元素溶液中每升含有1.5 g FeCl3·6H2O，0.15 g H3BO3，0.03 g CuSO4·5H2O，0.18 g KI，0.12 g MnCl2·4H2O，0.06 g Na2MoO4·2H2O，0.12 g ZnSO4·7H2O，0.15 g CoCl2·6H2O 和 10 g乙二胺四乙酸(EDTA).

1.3 常規測定方法

常規水質檢測方法均采用國家環境保護總局發布的標準方法測定.pH值、DO采用WTW Multi 340i在線測定.聚-β-羥丁酸(PHB)、羥基丁酸酸共聚酯(PHV)、PH2MV 按照改良后的 Oehmen等［7］的方法測定，采用Agilent6890N型氣相色譜儀及Agilent DB－1型氣相色譜柱，分別以3-羥基丁酸和3-羥基戊酸(體積分數比為95%∶5%，Fluka，Buchs SG，Switzerland)作為標準物質測定.葡萄糖采用苯酚 －硫酸比色法測定.VFA采用 Agilent6890N型氣相色譜儀測定.

1.4 FISH分析方法

分別在反應器運行的第1，80，250，340天取泥樣，使用FISH技術測定反應器內生物群落［8］.

2 結果與分析

2.1 反應器運行效果分析

反應器共運行364 d，根據除磷效果可以分為3個階段.由圖1可知，第1階段(第0～80天)系統運行不穩定，出水PO3－4-P濃度在10 mg/L上下波動，磷去除率小于50%;隨著運行時間的增加系統除磷性能逐漸增強，第3階段(第180天后)除磷效果逐漸穩定，最高釋磷量達到80 mg/L，出水PO3－4-P濃度穩定在1 mg/L，除磷效率大于90%.Hollender等［9］比較了乙酸與葡萄糖為碳源時對EBPR系統的影響，發現葡萄糖為碳源時磷系統厭氧釋磷量僅為17～19 mg/L，低于乙酸為碳源的除磷系統(27 mg/L).本試驗最終的最高厭氧釋磷量達到80 mg/L，出現較高的厭氧釋磷現象，說明反應器運行狀況良好，PAOs富集程度較高.

研究表明，GAOs可以直接吸收利用葡萄糖，而PAOs只能以VFA為碳源，不能直接以葡萄糖為電子供體［4－5，10］.在以葡萄糖為基質的除磷系統內，PAOs與GAOs競爭時處于劣勢，一旦系統碳源不足就會使除磷效果惡化.Zengin等［4］研究表明，隨著運行時間的增加，EBPR中會滋生出大量絲狀細菌，導致厭氧段無法充分釋磷，好氧吸磷量減少，系統崩潰.本試驗中并未發現絲狀膨脹，但是系統運行比較脆弱，相比乙酸與丙酸等作為碳源的系統抗沖擊負荷較差，系統運行至第230天和第330天時，由于運行故障，導致厭氧段碳源不足，之前穩定的系統立即惡化(見圖1)，但故障修復后，系統除磷效果也很快恢復.

圖1 系統運行364 d的磷濃度及COD變化

2.2 反應器典型周期運行分析

圖2 COD，PO3－4-P，PHA和糖原的變化

圖2為反應器運行至3個不同時期(第80，250，340天)時典型運行周期內反應效果圖.厭氧開始20 min后，PAOs將大部分 COD去除(見圖2)，同時進行厭氧釋磷和合成PHA，PO3－4-P濃度與PHA急劇升高.20 min后PO3－4-P濃度保持平穩.3個典型周期厭氧結束時水樣中PO3－4-P濃度分別為18 mg/L(第80 天)、51.63 mg/L(第 250 天)和89.7 mg/L(第340天)，釋磷量逐漸升高.泥樣中厭氧合成 PHA 量(以碳計)分別為1.09，1.73，1.2 mmol/L，PO3－4-P去除率分別為49.2%，98.0%，97.2%(見表 2)，最終系統維持高效且穩定的運行效果.如圖2所示，第80天與第250天溶液中，PO3－4-P濃度峰值都不是出現在厭氧結束時，厭氧階段末期出現不同程度的“厭氧吸磷”現象.王亞宜等［11］在厭氧時間對反硝化除磷的影響進行研究時發現，當厭氧時間從60 min增加到90 min時，厭氧吸磷量增加;Kong等［12］也發現了同樣的厭氧階段磷濃度降低現象.但是目前對這種“厭氧吸磷”的現象還沒有明確的解釋.本試驗中使用的是敞口式SBR，可能是厭氧末期溶入氧氣導致聚磷菌利用PHA好氧合成Poly-P，出現這種“厭氧吸磷”現象的原因還有待更深入的研究.

表2 比吸放磷速率、磷去除率、PHA合成及分解比較

比較3個階段運行狀況，第250天期間與250～340 d期間出水磷濃度相差不大，雖然第340天磷去除率略低于第250天，但其比吸磷速率、比釋磷速率與厭氧釋磷量均比第250天高1倍以上(見表2)，說明3個時期中第340天的系統運行效果最佳.第 340天比釋磷速率達到 261.34 mg/(g·d).侯洪勛等［13］以厭氧/好氧氧化溝工藝為研究對象，發現葡萄糖為碳源時比釋磷速率僅為49.4 mg/(g·d)，本試驗中出現較高的比釋磷速率可能是由于系統中PAOs富集程度較高.

第250天PHA合成量與分解量高于第340天，但第340天的比釋磷速率與厭氧釋磷量是第250天的2倍以上(見表2).出現這種現象的原因可能是PHA由PAOs與GAOs共同合成，運行過程中PAOs比例不斷升高，GAOs比例降低，由于GAOs無釋磷能力，導致PHA合成量變化不大，厭氧釋磷量與比釋磷速率急劇升高.以葡萄糖為碳源的除磷系統中PHA以PHV為主，而乙酸為碳源時PAOs合成 PHA 以 PHB 為主［9，14－16］.黃惠珺等［17］研究表明，葡萄糖為碳源時PHB與PHV質量分數分別為77%與23%.本試驗中只檢測出PHB與PHV，未檢測出PH2MV.PHA以PHV為主，3個典型周期PHV質量分數分別為49.54%(第0～80天)，92.57%(第 80～250天)和 90%(第 250～340天).

2.3 厭氧段PAOs底物貯存及釋磷情況

目前對葡萄糖在EBPR中的厭氧代謝途徑沒有明確定義，葡萄糖在厭氧階段被發酵細菌分解為乙酸、丙酸、乳酸等揮發性脂肪酸［3，5，15］.本試驗對厭氧段PAOs對底物貯存及釋磷情況進行研究，試驗進水PO3－4-P濃度為10 mg/L，葡萄糖濃度為200 mg/L，實驗過程中不控制pH值.圖3為樣品中葡萄糖、PO3－

4-P、PHA、VFA濃度、pH 及 DO變化曲線.如圖3所示，30 min內pH值由9.77急劇下降至7.08，5 min時葡萄糖濃度急劇下降至94 mg/L，此時測得VFA含量(以COD計)為43 mg/L，30～90 min內 VFA濃度維持在30 mg/L左右，說明EBPR中存在分解葡萄糖作為VFA的厭氧發酵細菌.實驗過程中檢測到的VFA濃度較低，與理論產生值不符，這可能是由于PAOs吸收VFA速率較快，而厭氧發酵型細菌分解葡萄糖速率不高所致.Jeon等［5］研究了EBPR中細菌對葡萄糖的厭氧代謝過程，發現發酵細菌能分解葡萄糖產生乳酸，PAOs再將乳酸轉化成PHA，本試驗中VFA檢測項目為乙酸、丙酸、丁酸，不包含乳酸，這也可能是導致檢測到的VFA濃度低于理論值的原因.

由圖3可見，在30 min時葡萄糖濃度降低至11.9 mg/L，之后溶液中葡萄糖濃度不再降低，而PHA與PO3－4-P濃度持續升高.由表3可知，雖然0～30 min葡萄糖濃度降低了188.1 mg/L，占總葡萄糖消耗的99.5%，但厭氧釋磷量和PHA合成量分別為39.9 mg/L與1.29 mmol/L，僅占總釋磷量和總PHA合成量的72.3%與42.3%.在30～150 min內，葡萄糖濃度降低了0.96 mg/L，釋磷量和PHA合成量分別為15.29 mg/L與1.76 mmol/L，分別占總釋磷量和 PHA合成量的 27.7%與57.7%.說明前30 min葡萄糖并未被完全消耗降解，濃度急劇降低只是由于被發酵細菌吸附，厭氧過程中發酵細菌將吸附的葡萄糖分解為VFA，PAOs吸收利用VFA進行厭氧釋磷.

圖3 葡萄糖、PHA、VFA、PO3－4-P濃度與pH，DO變化曲線

表3 厭氧時每個時間段葡萄糖減少量、PHA合成量和釋磷量

2.4 EBPR系統菌群的FISH分析

對第1，80，250，340天活性污泥進行FISH檢測，圖4和圖5分別為第1天和第340天 PAOs與GAOs的 FISH檢測圖.應用 FISH計算 PAOs與GAOs占全菌比例，結果如表4所示，接種污泥中PAOs僅占全菌的4.29%，存在大量異養菌等其他菌群.在系統運行過程中，PAOs大量繁殖，運行至第80，250和340天時其質量分數分別為14.91%，27.1%，45.5%.第250天 GAOs占全菌質量分數為15.19%，第340天時下降至4.26%，遠低于PAOs所占比例(45.5%)，這與3個典型周期分析結論一致.與第250天相比，第340天時PAOs比例升高，GAOs比例降低，導致PHA合成量變化不大，但厭氧釋磷量與比釋磷速率急劇增高.

圖4 GAOs熒光原位雜交分析結果

由于 GAOs可以直接吸收利用葡萄糖，而PAOs 只能利用 VFA［4，5，10］，這可能導致葡萄糖作為碳源的EBPR中GAOs成為優勢菌.李安安等［18］在磷限制條件下，以葡萄糖為單一碳源，采用厭氧/好氧交替運行的SBR反應器對活性污泥馴化，富集培養出了穩定的聚糖菌顆粒污泥.本文實驗研究結果表明，通過嚴格控制DO、pH值、溫度、碳磷比、厭氧時間及污泥齡等運行條件，以葡萄糖為碳源的生物除磷系統長期運行也能夠富集培養出較高濃度的聚磷菌.

圖5 PAOs熒光原位雜交分析結果

表4 PAOs與GAOs占全菌的比例變化 %

3 結論

1)180 d后系統出水PO3－4-P濃度穩定在1 mg/L以下，最高厭氧釋磷量達到80 mg/L，除磷效率保持90%以上，雖然出現過效果惡化的現象，但系統在長期運行中仍然可以維持相對穩定的高效生物除磷.

2)考察了3個不同階段典型周期(第0～80天，第81～250天，第251～340天)的系統運行效果，隨著運行時間的增加除磷效果增強，3個階段典型周期中第251～340天期間運行效果最佳，厭氧釋磷量達到79 mg/L，比釋磷速率達到261.34 mg/(g·d)，PHA 合成量為 1.2 mmol/L，厭氧合成PHA中PHV和PHB質量分數分別為90%與10%，未檢測到PH2MV.

3)對厭氧段PAOs底物貯存轉化的研究表明，葡萄糖先被發酵細菌分解為VFA，PAOs吸收葡萄糖分解產生的VFA而進行厭氧釋磷.

4)FISH檢測結果表明，反應器在第250～340天運行期間，PAOs濃度逐漸增高.第340 d時PAOs達到45.5%，GAOs只有4.26%，以葡萄糖為碳源的EBPR系統長期運行也可以富集較高濃度的PAOs.

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Long term effect of glucose as sole carbon source on EBPR and PAOs enrichment

Peng Yongzhen Xue Guisong Miao Zhijia Weng Dongchen
(Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China)

Abstract:To study the long term effect of glucose on the performance of enhanced biological phosphorus removal(EBPR)system，a laboratory scale sequencing batch reactor(SBR)fed with glucose was operated for 364 days.The SBR performance of three typical cycles in different periods was compared.The effect of glucose on anaerobic substrate storage and conversion of phosphate-accumulating organisms(PAOs)was discussed，and the quantity of populations of PAOs and glycogen accumulating organism(GAOs)was detected with fluorescent in situ hybridization(FISH).The results indicate that the system shows high and stable phosphorus removal efficiency after 180 days，the highest phosphorus release can reach 80 mg/L and the effluent concentration of PO34－-P is less than 1 mg/L.Compared with the typical cycles in the 1st and 2nd period，the typical cycle in the 3rd period showed the best performance，the anaerobic phosphorus release reaches 79 mg/L and phosphorus release rate is 97.2%.It is indicated that fermentative bacteria first converts glucose to volatile fatty acids(VFAs)and then PAOs utilize the VFAs to synthesize poly-hydro xyalkanoate(PHA).The proportion of PAOs keeps increasing rapidly and reaches 45.5%at 340 days.The FISH analysis results indicate that it is possible for EBPR using glucose as the sole carbon source to develop a system with high proportions of PAOs.

Key words:enhanced biological phosphorus removal;glucose;volatile fatty acid;polyphosphate accumulating organism;glycogen accumulating organism

中圖分類號:X703.1

A

1001－0505(2013)01-0136-06

doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.026

收稿日期:2012-04-12.

彭永臻(1949—)，男，博士，教授，博士生導師，pyz@bjut.edu.cn.

基金項目:高等學校博士學科點專項科研基金(優先發展領域)資助項目(20111103130002)、城市污水高效脫氮除磷新工藝與節能降耗關鍵技術研發資助項目(D121100000112001).

引文格式:彭永臻，薛桂松，苗志加，等.葡萄糖為碳源的EBPR長期運行效果及聚磷菌的富集培養［J］.東南大學學報:自然科學版，2013，43(1):136 －141.［doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.026］