納米材料修飾電極上吸附態葡萄糖氧化酶的酶活性和電活性的比較

楊大威 陳 超 謝青季 姚守拙

(湖南師范大學化學化工學院,化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室,長沙410081)

1 引言

葡萄糖氧化酶(GOx)常被用作安培酶電極領域的模型酶加以研究,也直接服務于糖尿病人血糖檢測和監測的巨大臨床需求.1-6GOx是一種同型二聚體蛋白質分子,有兩個黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氧化態活性中心,可高選擇性地快速催化葡萄糖的氧化.在這個酶催化反應中,酶的氧化態活性中心FAD被葡萄糖還原成其還原態FADH2.顯然,需要額外的氧化劑(媒介體)將FADH2重新氧化(翻轉)為FAD,從而實現酶催化反應的循環過程.根據所選用的媒介體氧化劑的不同,可將葡萄糖安培酶電極分為以下三代.

第一代GOx安培酶電極利用溶液中的溶解O2這一天然電子媒介體實現從還原態FADH2到氧化態FAD的“翻轉”:

通過安培檢測O2的還原,或者酶生H2O2的氧化或還原,可間接檢測葡萄糖.第二代葡萄糖安培酶電極使用二茂鐵衍生物、苯醌等作為人工媒介體代替第一代中的天然媒介體O2;而第三代葡萄糖安培酶電極是指酶與電極間直接發生電子轉移,即直接以電極為電子媒介體,實現翻轉酶還原態到其氧化態的傳感類型.

GOx安培酶電極的研究一直很活躍,近年來采用各種納米材料(如納米金、7,8碳納米管、8-10石墨烯11)作為酶固定載體的研究已成為該領域的前沿課題之一.然而,納米材料上GOx的生物活性保持及其與直接電化學行為相關性的定量研究似乎依然不多,盡管相關研究對于第三代安培酶電極研究具有重要意義.3

石英晶體微天平(QCM)是基于壓電石英晶體的逆壓電效應的聲波傳感器,是動態研究電極/溶液界面的重要表征手段,可監測電極表面納克級的質量變化,也對電極表面及其附近溶液的粘彈性變化等參數有靈敏響應.12-14同時進行QCM和電化學實驗的裝置稱為電化學石英晶體微天平(EQCM),是實時監測電化學過程的有力手段.15當剛性薄膜在QCM的一個電極表面上均勻地沉積或溶出時(純粹的質量效應),可用如下Sauerbrey方程來描述QCM諧振頻率改變(Δf0)和電極表面質量改變(Δm)間的關系:16,17

式中f0g為壓電石英晶體在氣相中的基頻;A為QCM電極的壓電活性面積;ρq=2.648 g·cm-3,為石英晶體密度;μq=2.947×1011g·cm-1·s-2,為晶體剪切模量.

對于液體粘密度效應,Kanazawa和Gordon17建立了相應的數學模型:

式中ρL為液體密度;ηL為液體粘度;n為石英晶體的觸液面數.

本文采用QCM技術,監測了GOx在裸金電極(Au)、電沉積納米金的電極(Aued/Au)、多壁碳納米管修飾的金電極(MWCNTs/Au)以及鍍金后的MWCNTs/Au電極(Aued/MWCNTs/Au)上GOx的吸附過程,并比較性地定量研究了各吸附態GOx(GOxi)的質量比生物活性(MSBAi)和電活性百分數(EAPi),旨在為納米材料固定酶及其安培酶電極的研究提供基礎物理化學數據.

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

所有電化學實驗均在CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)上進行,采用三電極系統,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極(本文電位均相對于SCE),自制的鉛筆芯電極為對電極;AT切9-MHz壓電石英晶體表面金電極(北京晨晶電子有限公司)為工作電極(WE).晶體單面觸液,晶體直徑12.5 mm,電極直徑6 mm.掃描電子顯微鏡(SEM)圖片采自QUANTA FEG 250場發射掃描電子顯微鏡(美國FEI公司).QCM和EQCM實驗采用計算機控制的HP4395A阻抗/網絡/頻譜分析儀.12,13

GOx(EC 1.1.3.4;黑曲霉來源,II型,活性約為150 kU·g-1,U為酶活性國際標準單位)購自Sigma公司并直接使用.葡萄糖(上海化學試劑公司)配制成1.00 mol·L-1水溶液,在使用前至少放置24 h使達光學異構體平衡.多壁碳納米管(MWCNTs,直徑20-40 nm,純度大于95%)購自深圳市納米港有限公司,氯金酸購自國藥集團化學試劑有限公司.文中所用緩沖溶液為pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS,30 mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4+0.10 mol·L-1K2SO4).所有其它試劑均為分析純或優級純,且使用前未進一步處理.實驗用水為Milli-Q超純水(Millipore,≥18 MΩ·cm).所有實驗在室溫(約25 °C)進行.

2.2 實驗步驟

2.2.1 Au、Aued/Au、MWCNTs/Au和Aued/MWCNTs/Au電極的制備

Au電極制備:用704硅橡膠將一壓電石英晶片密封在聚氯乙烯(PVC)管的一端,使電極單面觸液.為去除電極表面可能的雜質,在電極表面滴加濃硝酸后靜置約10 s,然后用超純水洗凈,并用氮氣吹干,如此重復三次.而后將電極置于0.20 mol·L-1HClO4中進行多圈的循環伏安(CV)實驗,直至得到可重現的循環伏安圖.這里,因為長時間的H2SO4處理對封制電極的704硅橡膠有一定的腐蝕作用,故選擇HClO4.圖1為新QCM電極第一次電化學處理時的CV曲線及頻率響應.在第一圈中當電位從0 V往正掃描時,明顯觀察到在金氧化電位區間(1.0-1.5 V)內,出現較大的氧化電流和頻率上升,表明廠家噴鍍的電極表面有一些附著不牢固的金顆粒易于陽極溶出.本實驗室10多年來一直能重復觀察到這種QCM新鮮金電極的陽極溶出現象,本文為首次報道此現象.電位陰極回掃時,約0.8 V處有金氧化物還原的陰極峰,隨后在0.6 V處有另一個較小的陰極峰,這是由于溶出的Au(III)在電極表面被還原.第二圈時電極表面不牢固的金原子的溶出電流明顯降低,溶出的Au(III)在電極表面被還原的陰極電流也減少.約經過3圈CV掃描后,這些附著不牢固的表面金原子溶出殆盡,從而可觀察到重現的CV曲線和QCM響應.13然后,將電極置于2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中進行電位環掃,氧化還原峰峰電位寬一般在85 mV以內(圖2a),表明Au電極已處理干凈.

Aued/Au電極制備:將處理好的Au電極置于含1.00 mmol·L-1氯金酸的0.10 mol·L-1H2SO4水溶液中,采用多電位階躍法在初始電位0.8 V下運行2 s,階躍至-0.3 V運行200 s進行電沉積.測量電沉積前后石英晶體的干頻,根據頻率差計算出電沉積Au的總質量(見表1).經掃描電鏡表征(圖3)表明所沉積的金為納米顆粒(NP),分散較好.電沉積納米金前后分別將電極置于2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中,在-0.1-0.5 V(vsSCE)電位區間環掃,鍍金前后電極的電活性基本不變(圖2a).

MWCNTs/Au電極制備:將1.00 mg MWCNTs超聲分散于1.00 mL水中,得到均勻的黑色懸濁液,準確移取10.0 μL MWCNTs懸濁液滴干到Au電極表面,實時監測電極干燥過程的頻率變化,室溫下靜置待水分揮發后充分水洗,MWCNTs可牢固附著在Au表面形成MWCNTs/Au.測量該電極滴加MWCNTs前后的干頻和在2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中的循環伏安圖(圖2a),根據頻率差計算附著的MWCNTs的質量(見表1).

圖1 QCM新電極在0.20 mol·L-1HClO4溶液中進行循環伏安處理的電流(i)(a)和頻率(Δf0)(b)響應Fig.1 Current(i)(a)and frequency(Δf0)(b)responses during cyclic voltammetric treatment of a new QCM electrode in 0.20 mol·L-1HClO4aqueous solution

圖2 四種電極(a)及它們的酶電極(b)在2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中的循環伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of four electrodes(a)and enzyme electrodes(b)in 2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1 Na2SO4aqueous solution

表1 幾種酶吸附電極的MSBAi,ERA和EAPi＊Table 1 MSBAi,ERA,and EAPifor several GOx-adsorbed electrodes

Aued/MWCNTs/Au電極制備:MWCNTs/Au電極電沉積金的實驗操作同前.經掃描電鏡表征(圖3),所鍍金亦為納米顆粒.測量壓電石英晶體電極的干頻,根據頻率差分別計算滴干的MWCNTs、電沉積Au的質量和總質量變化(見表1).在2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中進行循環伏安實驗(圖2a).

用 SEM 表征了 Au、Aued/Au、MWCNTs/Au和Aued/MWCNTs/Au電極表面的形貌,如圖3所示.Au電極表面相對光滑,而Aued/Au電極表面有白色的金納米顆粒,平均尺寸約45 nm.MWCNTs/Au電極表面存在外壁光滑的MWCNTs;而Aued/MWCNTs/Au表面則可觀察到MWCNTs上附有許多平均尺寸約30 nm的金納米顆粒.

2.2.2 GOx的吸附

將Au、Aued/Au、MWCNTs/Au和Aued/MWCNTs/Au電極置于2.0 mL PBS(pH 7.0)溶液中,攪拌溶液待諧振頻率穩定后,加入PBS配制的3.0 mg·mL-1GOx溶液1 mL使最終GOx濃度為1.0 mg·mL-1,繼續實時記錄QCM頻率響應參數.待頻率相對穩定,取出電極,充分水洗并在空氣中風干,測量吸附前后QCM的干頻之差,即別為吸附前后QCM的干頻.據干頻之差代入公式(3)計算吸附的GOx質量Δm.將酶電極置于2.0 mmol·L-1K4Fe(CN)6+0.10 mol·L-1Na2SO4水溶液中于-0.1-0.5 V間進行電位環掃(圖2b).

由圖2a可見，氧化還原峰的峰-峰電位寬滿足Aued/MWCNTs/Au＞MWCNTs/Au≥Aued/Au≥Au 的 順序,峰 電 流 滿 足 Aued/MWCNTs/Au＞Au≥Aued/Au＞MWCNTs/Au的順序,兩者的變化幅度都不大.峰電位變化幅度不大主要說明各納米材料的導電性均很好;而峰電流變化幅度不大,是因為這里用到的電化學探針為可逆的電對,電對在電極表面的吸附效應也很小,其CV實驗中得到的電解電流應該是擴散電流占絕對優勢,故CV峰電流(應扣除背景電流)主要跟電極的幾何面積成正比關系,而與這里有限的納米材料修飾所帶來的電極真實面積增大并無明顯相關性.電容電流與電極的真實表面積成正比,而較明顯的電容電流增大出現在Aued/MWCNTs/Au電極上,這表明先修飾MWCNTs再電沉積納米Aued可相對更明顯地增大電極的真實面積.由圖2b可見,氧化還原峰的峰-峰電位寬滿足GOx/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/Au＞GOx/Au的順序,而峰電流滿足 GOx/Au＞GOx/Aued/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/Au＞GOx/MWCNTs/Au的順序,這里的變化幅度明顯大于無酶修飾的電極,且各電極經不導電的酶分子修飾后,峰電流都下降、峰峰電位寬都增加.以上結果表明各修飾步驟已完成.

圖3 Au(a),Aued/Au(b),MWCNTs/Au(c)和Aued/MWCNTs/Au(d)電極表面的SEM圖Fig.3 SEM images ofAu(a),Aued/Au(b),MWCNTs/Au(c),andAued/MWCNTs/Au(d)electrode surfaces

2.2.3 吸附態GOx用于催化氧化葡萄糖及其MSBAi和 EAPi的測量

將吸附GOx的電極置于10.0 mL PBS(pH 7.0)溶液中,攪拌,酶電極的安培檢測以恒電位下底物加入前后穩態電流的變化作為響應電流.待電流達穩態后,加入不同濃度的葡萄糖(MSBAi測試采用20.0 mmol·L-1葡萄糖),在優化電位0.7 V下檢測酶生H2O2的氧化電流.

將吸附GOx的電極置于10.0 mL PBS(除氧,pH 7.0)溶液中,在-0.7--0.2 V區間內進行電位環掃,得到各酶電極的直接電化學CV曲線圖.由CV圖的陽極峰電量和吸附酶的總質量,根據法拉第定律求算具有電活性的酶質量和吸附酶的電活性百分數.

3 結果與討論

3.1 GOx的吸附動力學研究

描述蛋白質吸附動力學過程最簡單的方法是考慮在電極/溶液界面發生的如下串聯過程:18,其中第一個過程為直接吸附(速率常數和時間常數分別為k1和τ1);第二個過程為吸附層中分子結構重組或后續第二層吸附(速率常數和時間常數分別為k2和τ2),故蛋白質在電極表面吸附的頻率響應(Δf0)可用2個指數函數之和來表示,19即

把 a0、a1、a2、τ1和τ2當作待估參數,采用作圖軟件 SigmaPlot?Scientific Graphing Software Version 10.0的非線性最小二乘擬合算法,擬合Δf0響應.為表征非線性擬合的質量,定義相對殘差平方和qr如下:19

式中Δf0fit和Δf0exp分別代表擬合值和實驗值,N代表響應信號的點數.

我們研究了GOx在Au、MWCNTs/Au、Aued/Au和Aued/MWCNTs/Au電極上的吸附情況,如圖4所示.擬合結果(實線)與實驗的頻率響應(圓圈)非常一致,所得擬合參數列于表2.GOx吸附過程的動態電阻響應均不大,即使在MWCNTs上吸附后的-Δf0/ΔR1亦達123 Hz·Ω-1,明顯大于純粘密度效應的理論值(-Δf0/ΔR1=10 Hz·Ω-1),12表明頻率響應主要為質量效應.

表2 按式(5)擬合圖4實驗中Δf0響應所得參數Table 2 Parameters obtained by fitting the experimental Δf0responses given in Fig.4 to Eq.(5)

a0為當吸附時間趨于∞時的頻移(對應于吸附量),GOx在MWCNTs/Au電極上吸附量最大,Aued/MWCNTs/Au和Aued/Au電極上次之,Au電極上最少.電極表面積、憎水性和荷電性質等因素可影響GOx在電極表面的吸附.因MWCNTs修飾和電沉積金均增大了電極表面積,而MWCNTs與GOx之間有疏水作用,有利于蛋白質吸附,18故不難解釋上述實驗現象.

3.2 吸附態GOx的MSBAi和EAPi的比較考察

3.2.1 吸附態GOx的MSBAi

MSBAi定義為每克固定酶的酶活性,即在60.0 s內產生1.00 μmol H2O2對應的酶活性,由H2O2氧化電量評估.采用EQCM技術,微量固定酶的MSBAi,游離酶活性(MSBAn)和相對比活性(ERA)可如下計算:18

式中nH2O2為葡萄糖濃度足夠大的飽和狀態下、60.0 s酶反應生成的H2O2量,單位為μmol,ΔmGOx為吸附GOx的質量,單位為g,z為H2O2氧化過程中電子轉移數(此處z=2),F為法拉第常數(96485.33 C·mol-1).ΔmGOx可據式(3)和干頻移計算.

圖4 四種電極表面對GOx吸附的Δf0響應Fig.4 Time courses of simultaneous Δf0responses to the GOx adsorption on four electrode surfaces

溶液中游離酶的比活性(MSBAn)求算如下.配制一系列不同濃度的H2O2溶液,在溶液攪拌條件下監測在0.7 V條件下Au電極上H2O2的氧化電流,繪制出工作曲線,求得線性回歸方程為iH2O2=acH2O2+b;在10.0 mL PBS(pH 7.0)溶液中加入能使酶反應飽和的葡萄糖溶液,待電流穩定后加入10.0 mg GOx,在攪拌的條件下記錄60.0 s時的電流響應為iH2O2(e).MSBAn可計算如下:

本文測得a=0.109,b=0.182,Vs=10.0 mL,iH2O2=4.3 mA,ΔmGOx=10.0 mg,由此可估算出MSBAn為37.7 kU·g-1.

GOx的酶相對比活性(ERA)定義如下:

圖5 四種酶電極在PBS中對葡萄糖濃度的安培響應工作曲線Fig.5 Current responses of four enzyme electrodes as functions of glucose concentration in PBS

本文還考察了四種酶電極對葡萄糖響應的工作曲線(圖5),并求得它們的靈敏度(S),檢測下限(LOD,S/N=3)和線性檢測范圍(LDR).S滿足GOx/MWCNTs/Au(2.94 mA ·mmol-1·L)＞GOx/Aued/MWCNTs/Au(1.94 mA·mmol-1·L)＞GOx/Aued/Au(1.75 mA·mmol-1·L)＞GOx/Au(0.83 mA·mmol-1·L)的順序;它們的LOD分別為GOx/Au:25 μmol·L-1,GOx/Aued/Au:13 μmol· L-1,GOx/MWCNTs/Au:14 μmol· L-1,GOx/Aued/MWCNTs/Au:9.8 μmol· L-1;LDR分別為GOx/Au:0.02-4.3 mmol·L-1,GOx/Aued/Au:0.02-3.1 mmol·L-1,GOx/MWCNTs/Au:0.02-2 mmol· L-1,GOx/Aued/MWCNTs/Au:0.02-2 mmol·L-1.吸附酶MSBAi受酶負載量、總酶活性(TEA,TEA=MSBAi×ΔmGOx)和電極表面傳質影響.20本文為電極表面單層級吸附酶,電極表面傳質好,故傳質不會顯著影響酶反應的進行.因此,本文中預期實驗中的靈敏度應與吸附酶的總酶活性有正相關關系.根據表1算得總酶活性滿足如下順序:GOx/MWCNTs/Au(TEA=1.68 kU)＞GOx/Aued/MWCNTs/Au(TEA=1.36 kU)＞GOx/Aued/Au(TEA=1.2 kU)＞GOx/Au(TEA=0.588 kU),該順序與各酶電極的安培響應靈敏度的順序一致,從而驗證了預期的規律.

3.2.2 吸附態GOx的EAPi

吸附態酶的電活性百分數(EAPi)定義為具有電活性的酶質量(Δme,GOx)占吸附酶總質量(Δmt,GOx)的百分比,通過QCM監測酶飽和吸附的質量和CV法研究酶電極在PBS(除氧,pH 7.0)溶液中的直接電化學(圖6),EAPi可如下計算:

EPAi=Δme,GOx/Δmt,GOx=(QGOxMGOx)/(zFΔmGOx)(10)式中QGOx為酶電極循環伏安圖的陽極峰電量(μC),MGOx為酶的分子量(154000 g·mol-1),z為GOx氧化還原過程中的電子轉移數(此處z=4).結果列于表1.

圖6 四種酶電極在PBS溶液(除氧)中的循環伏安圖Fig.6 Cyclic voltammograms of four enzyme electrodes in PBS(deoxygenated)

上述實驗結果討論如下:(1)金電極上修飾1.48 μg MWCNTs后,酶吸附質量由裸金電極上的0.124 μg 增加到了 0.608 μg,但 MSBAi由裸金電極的4.70 kU·g-1降低到2.76 kU·g-1,其ERA也從12.5%降到7.30%,但安培響應電流增大(圖5(c)),因總酶活性增加的緣故;同時其EAPi和裸金電極相比有所增大(圖6).這說明MWCNTs與GOx發生了某種作用(比如疏水作用),使吸附酶比活性降低,而其電活性的增大說明GOx在MWCNTs表面吸附后,可能發生一定的構象變化,使得深埋于酶分子內的電活性位點暴露出來;(2)QCM金電極上電沉積2.26μg金后,酶吸附量由裸金電極上的0.124 mg增加到了0.288 mg,吸附酶的MSBAi(4.20 kU·g-1)與裸金電極(4.70 kU·g-1)相比有所下降,其ERA也如此;同時其電活性百分數也稍有下降.這說明吸附在微/納金顆粒上的GOx的酶比活性和酶構象變化較小,故電活性也變化不大;(3)金電極上修飾1.43 mg MWCNTs后再鍍金2.15 mg后,酶吸附量和裸金電極相比有所增大,吸附酶的MSBAi增大到4.26 kU·g-1,也和Aued/Au電極基本一致;同時因MWCNTs的存在,吸附酶的電活性也變得較為明顯.

4 結論

采用QCM技術監測了GOx在Au、Aued/Au、MWCNTs/Au和Aued/MWCNTs/Au電極上的吸附過程;測算了吸附酶的比活性和電活性.結果表明,GOx在各電極表面上均可快速吸附,且吸附態GOx均有一定的酶活性.四種酶電極上吸附酶的質量和安培響應滿足GOx/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/Au＞GOx/Au的順序;MSBAi滿足GOx/Au＞GOx/Aued/MWCNTs/Au≥GOx/Aued/Au＞＞GOx/MWCNTs/Au的順序;而 EAPi滿足 GOx/MWCNTs/Au＞GOx/Aued/MWCNTs/Au＞＞GOx/Au≥GOx/Aued/Au.根據酶和納米材料的親疏水作用以及酶的吸附量對實驗結果進行了合理解釋,也定量驗證了電極上吸附酶分子的總生物活性與酶電極的安培響應呈正相關關系.以上結果表明,多壁碳納米管在構建高性能葡萄糖生物傳感器中能大大增加酶吸附量和電化學活性,但其具有不利于酶生物活性的特性,值得研究者特別注意.而鍍金處理的電極能在一定程度上增大酶負載量,且對酶活性和電化學活性影響不大.我們認為,金和碳納米材料的組合是比較好的酶固定納米材料,本文工作將有助于納米材料固定酶及其安培酶電極的研究.

(1) Wang,J.Electroanalysis 2001,13,983.

(2)Ianniello,R.M.;Yacynych,A.M.Anal.Chem.1981,53,2090.doi:10.1021/ac00236a033

(3)Chen,C.;Xie,Q.J.;Yang,D.W.;Xiao,H.L.;Fu,Y.C.;Tan,Y.M.;Yao,S.Z.RSC Adv.2013,3,4473.doi:10.1039/c2ra22351a

(4)Wang,J.Chem.Rev.2008,108,815.

(5)Alex,H.H.T.;Fabio,L.;Simone,R.S.;Gilberto,M.J.Phys.Chem.C 2012,116,18857.doi:10.1021/jp305633v

(6)Yang,C.;Xu,C.X.;Wang,X.M.Langmuir 2012,28,4580.doi:10.1021/la2044202

(7) Tellechea,E.;Wilson,K.J.;Bravo,E.;Schifferli,K.H.Langmuir 2012,28,5190.doi:10.1021/la2050866

(8)Jeong,B.;Akter,R.;Han,O.H.;Rhee,C.K.;Rahman,M.A.Anal.Chem.2013,85,1784.doi:10.1021/ac303142e

(9) Goran,J.M.;Mantilla,S.M.;Stevenson,K.J.Anal.Chem.2013,85,1571.doi:10.1021/ac3028036

(10)Wang,T.;Fu,Y.C.;Bu,L.J.;Qin,C.;Meng,Y.;Chen,C.;Ma,M.;Xie,Q.J.;Yao,S.Z.J.Phys.Chem.C.2012,116,20908.doi:10.1021/jp306492a

(11)Alwarappan,S.;Boyapalle,S.;Kumar,A.;Li,C.Z.;Mohaparea,S.S.J.Phys.Chem.C 2012,116,6556.doi:10.1021/jp211201b

(12) Xie,Q.J.;Wang,J.;Zhou,A.;Zhang,Y.Y.;Liu,H.;Xu,Z.;Yuan,Y.;Deng,M.;Yao,S.Z.Anal.Chem.1999,71,4649.doi:10.1021/ac981390z

(13) Xie,Q.J.;Xiang,C.;Yuan,Y.;Zhang,Y.;Nie,L.;Yao,S.Z.J.Colloid Interface Sci.2003,262,107.doi:10.1016/S0021-9797(03)00196-6

(14) Marx,K.A.Biomacromolecules 2003,4,1099.doi:10.1021/bm020116i

(15)Buttry,D.A.;Ward,M.D.Chem.Rev.1992,92,1355.doi:10.1021/cr00014a006

(16) Sauerbrey,G.Z.Phys.1959,155,206.doi:10.1007/BF01337937

(17) Kanazawa,K.K.;Gordon,J.G.Anal.Chem.Acta 1985,175,99.doi:10.1016/S0003-2670(00)82721-X

(18)Chen,X.;Zhang,Q.L.;Su,Y.H.;Meng,W.H.;Xie,Q.J.;Yao,S.Z.Acta Phys.-Chim.Sin.2007,23,1201.[陳 昕,張漪麗,蘇育華,孟文華,謝青季,姚守拙.物理化學學報,2007,23,1201.]doi:10.3866/PKU.WHXB20070812

(19) Xie,Q.J.;Zhang,Y.Y.;Xu,M.C.;Yao,S.Z.J.Electroanal.Chem.1999,478,1.

(20) Fu,Y.C.;Li,P.H.;Bu,L.J.;Wang,T.;Xie,Q.J.;Chen,J.H.;Yao,S.Z.Anal.Chem.2011,83,6511.doi:10.1021/ac200471v