Klebsiella sp.B－36的分離鑒定及產(chǎn)脂肪酶特性研究

惠 明 張開平，2 田 青 高春媛

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1，鄭州 450001)

(百色學(xué)院2，百色 533000)

脂肪酶(EC3.1.1.3)又稱三酰基甘油水解酶，是繼蛋白酶和糖化酶之后的第三大類酶［1］，是一類可催化長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯分解成甘油和長(zhǎng)鏈脂肪酸的生物催化劑，也可以催化該反應(yīng)的逆反應(yīng)［2］。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，其中微生物來(lái)源脂肪酶極其豐富，具有比動(dòng)植物源脂肪酶更寬的作用pH和作用溫度范圍，便于工業(yè)化生產(chǎn)獲得高純度酶制劑［3］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)脂肪酶耐高溫、耐酸等特性提出了新的要求，并且已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，但耐高溫、耐酸性脂肪酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件十分苛刻，脂肪酶的獲得非常困難，相關(guān)研究論文并不多見［4－6］。針對(duì)脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中的特殊酶學(xué)性質(zhì)需求，尋找性能優(yōu)良的耐熱、耐酸以及符合現(xiàn)代生物工程需求的產(chǎn)脂肪酶菌株是脂肪酶應(yīng)用研究開發(fā)的基礎(chǔ)，因此，獲得耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌具有重要意義。本試驗(yàn)從鄭州市西郊富含油酯的土壤中分離篩選目標(biāo)菌株，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為后續(xù)菌種改良及該菌產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集

在鄭州西郊的榨油廠、飼料廠、汽車修理廠、花生地、菜市場(chǎng)、餐廳下水道等富含油污的土壤中，共采集50余個(gè)樣本，標(biāo)記后備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑:橄欖油(西班牙產(chǎn))、聚乙烯醇、三丁酸甘油酯、溴甲酚紫、吐溫－80:國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器:HZQ－F160全溫振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱東聯(lián)電子有限公司;PYX－DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;H1650－W臺(tái)式高速離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司;YS 100攝像顯微鏡:日本Nikon;BSll0S電子天平:北京賽多利斯有限公司;JSM－6390LV型掃描電子顯微鏡:日本電子株式會(huì)社;TP600 PCR擴(kuò)增儀:日本 TaKaRa BIO INC.;Mupid核酸電泳儀:泰國(guó) ADVANCE－BIO Co.，Ltd;3730XL DNA測(cè)序儀:美國(guó) Applied Biosystem公司等。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L):酵母膏 5.0，KH2PO41.5，Na2HPO42.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 1.0，橄欖油10.0 mL/L，pH 6.0。

溴甲酚紫平板初篩培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏 5.0，NaCl 5.0，K2HPO41.0，瓊脂 15.0，PVA－ 橄欖油乳化液120 mL/L，Tween －80 4.0 mL/L，pH 6.0。培養(yǎng)基冷卻到60℃時(shí)，按0.4%加入過(guò)濾除菌后的溴甲酚紫指示劑(50 mg/100 mL，pH 6.5)，無(wú)菌條件下乳化倒平板。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 5.0，MgSO4·7H2O1.0，K2HPO41.0，(NH4)2SO45.0，葡萄糖 10.0，橄欖油 10.0 mL/L，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 5.0，酵母膏 20.0，蔗糖20.0，MgSO4·7H2O 1.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，橄欖油 10.0 m/L，pH 6.0。

三丁酸甘油酯培養(yǎng)基:PVA－三丁酸甘油酯乳化液20.0 mL，LB 培養(yǎng)基18.0 mL，pH 5.5 乙酸 －乙酸鈉緩沖液 1 000 mL，瓊脂 18.0 g。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

富集培養(yǎng):稱取2 g土樣溶于20 mL無(wú)菌水中，振蕩搖勻制成土壤懸液，靜置，取每種土壤懸液3 mL加入到盛有50 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，置于45℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，無(wú)菌操作移取1 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，相同條件下重復(fù)富集培養(yǎng)3輪［7］。

初篩培養(yǎng):吸取1.0 mL富集培養(yǎng)液于9.0 mL無(wú)菌水中，將菌液進(jìn)行梯度稀釋至1×10－5～1×10－7倍，分別取 50 μL涂布于平板初篩培養(yǎng)基，40℃倒置培養(yǎng)48～72 h，觀察有無(wú)黃色透明水解圈，通常菌落水解圈直徑與菌落直徑之比值(D/d)越大，該菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。將水解圈大的單菌落挑至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，然后4℃保藏，以供復(fù)篩備用［8］。

復(fù)篩培養(yǎng):將初篩挑選的菌株進(jìn)行劃線分純。挑取一環(huán)分純后的菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，40℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后按1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，40℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h［9］。

1.2.2 粗酶液的制備

Klebsiella sp.B－36經(jīng)富集培養(yǎng)48 h后，取少量發(fā)酵液，12 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液即為粗酶液［10］。

1.2.3 酶活測(cè)定

采用橄欖油－聚乙烯醇乳化液滴定法，參照國(guó)標(biāo) GB/T 23535—2009［11］。

1.2.4 酶活定義

1 mL液體酶，在40℃和pH 7.5條件下，反應(yīng)15 min，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位(U)，以U/mL表示。

1.2.5 酸性脂肪酶菌株的篩選

采用三丁酸甘油酯瓊脂平板鑒定法，操作步驟參考王琰等［12］。

1.2.6 菌株鑒定

形態(tài)觀察:根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［13］以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［14］，對(duì)篩選的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和生理生化鑒定。

分子鑒定:測(cè)定特異性基因(16S rDNA)序列，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上檢索比對(duì)。試驗(yàn)方法如下:①變性:挑取B－36菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)中變性后離心取上清作為模板，反應(yīng)條件為80℃，15 min。②PCR擴(kuò)增:使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系為前述①的變性反應(yīng)液1 μL，PCR Premix 25 μL，F(xiàn)orward primer(20 pmol/μL)0.5 μL，Reverse primer2(20 pmol/μL)0.5 μL，16S － free H2O 23 μL;反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃，5 min，1 cycle;94 ℃變性 1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 cycles;72℃延伸5 min，1 cycle;取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.D823A)，切膠回收目的片段。③測(cè)序:以Seq Forward、Seq Internal和Seq Reverse為引物進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.7 酶學(xué)特性研究

酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性:將酶液分別在35～75℃條件下測(cè)酶活，確定該酶的最適反應(yīng)溫度，然后將酶液分別置于不同溫度(40～80℃)的恒溫水浴鍋中保溫70 min，每隔10 min取樣測(cè)定殘余酶活［15］。

酶反應(yīng)的最適pH值和pH穩(wěn)定性:用磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系進(jìn)行脂肪酶水解活力的測(cè)定，在不同pH(2.0～8.0)條件下測(cè)酶活，確定該酶的最適pH值，然后將酶液與不同pH值(2.0～6.0)緩沖液以1∶3的比例混合，40℃靜置1 h后測(cè)酶活［16］。

金屬離子對(duì)酶活力的影響:分別將酶液與10 mmol/L 的 Ca2+、K+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、EDTA、Na+和Mg2+等體積混合，室溫下靜置1 h后測(cè)酶活，以未添加任何金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

經(jīng)過(guò)富集、初篩、復(fù)篩等過(guò)程，用溴甲酚紫平板從富含油脂的土壤中篩選得到產(chǎn)脂肪酶的菌株，其中大部分的酶活都在5.0～9.6 U/mL之間。對(duì)酶活力9.0～9.6 U/mL的菌株進(jìn)行酸性三丁酸甘油酯平板篩選，得到8株能夠在pH 5.5的酸性平板上生長(zhǎng)并且有透明的水解圈，將以上篩選到的8株菌按1%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，40℃、160 r/min培養(yǎng)48 h后測(cè)酶活，其中B－36菌株酶活力最高，為9.2 U/mL。雖然其初步發(fā)酵酶活力同已知相關(guān)菌種伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)(酶活力達(dá)50.50 U/mL)［17］及地霉屬(Galactomyces geotrichum)真菌 FL002(酶活力達(dá) 75.50 U/mL)［12］有一定差距，但考慮到菌種資源發(fā)掘的特殊性(事實(shí)上采用Klebsiella sp.發(fā)酵產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道)，本試驗(yàn)選擇B－36菌株作為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

將篩選到的B－36菌株涂布于溴甲酚紫平板初篩培養(yǎng)基上進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落呈黃色或橙色，表面光滑凸起，革蘭氏染色陰性，掃描電鏡(SEM)觀察(圖1)，菌體大小為0.5 ～0.8 ×1 ～3 μm之間，單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。常規(guī)生理生化測(cè)試表明，菌株B－36甲基紅試驗(yàn)陰性，V.P.試驗(yàn)陰性，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，乳糖、木糖、蔗糖、D－山梨醇，不發(fā)酵D－阿拉伯糖、D－甘露醇，水解淀粉，石蕊牛奶試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，亞硝酸還原陰性，不液化明膠，產(chǎn)脂酶，不產(chǎn)脲酶，不產(chǎn)吲哚。

圖1 菌株B－36的形態(tài)觀察(SEM)(放大12 000倍)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株B－36 16S rRNA基因含有高度保守的基因片段，大約1.5 Kb，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳見圖2，在1 000～2 000 bp之間有明顯的條帶，這表明PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了預(yù)期長(zhǎng)度的16S rDNA序列，送到大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)(登錄號(hào):JQ793784)，用 MEGA 4.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。構(gòu)建結(jié)果如圖3。與菌株B－36序列相似度高的相關(guān)菌株均為克雷伯氏菌屬，系統(tǒng)發(fā)育分析得出該菌與 HM352367.1(Klebsiella sp.)在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)99%以上，再結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，可以初步鑒定該菌為克雷伯氏菌，命名為 Klebsiella sp.B －36。

圖2 16S rDNA基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)得的B－36菌株16S rDNA序列如下:ACGCTGGCGGCAGGCCTAA CACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCT CTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCT GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA ACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAA GTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCC CAGATGGGATTAGCTGGTAGGTGGGGTAACGGCTCAC CTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACC AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG CAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAG GCGGTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCC GCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGT CGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA TTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGG TA GAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT CTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA CAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAA CGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGC TTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAG TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA TGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAC AGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACT GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT TGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTC AAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGG CTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAG CGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATG TCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATG AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTA CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTA GCTTAACTCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATT CATGACTGGG(1455 bp)

圖3 菌株B－36系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 菌株B－36酶學(xué)特性

2.3.1 酶反應(yīng)最適溫度和熱穩(wěn)定性

在35～75℃，間隔5℃的不同溫度下測(cè)酶活，結(jié)果如圖4a可知，該酶的適宜反應(yīng)溫度為60℃，但是在75℃時(shí)，該酶依然存在50%的活性，屬于高溫脂肪酶。此外，將酶液置于40～80℃，間隔10℃的不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫70 min，每隔10 min取樣，在60℃下測(cè)酶活，用未經(jīng)處理的酶液作對(duì)照。結(jié)果見圖4b，該酶在60℃之內(nèi)穩(wěn)定性較好，處理70 min中酶活力還保持在80%以上，當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，酶活力逐漸降低，但70、80℃處理30 min后對(duì)酶活力無(wú)顯著影響，均保持在80%以上。70℃處理70 min后還有70%的酶活力;80℃處理70 min后還有46%的酶活力，說(shuō)明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。目前，國(guó)外已報(bào)道熱穩(wěn)定性較好的耐熱脂肪酶——環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulansⅢB153)脂肪酶，該酶在40～60℃之間具有良好的熱穩(wěn)定性，在60℃處理1 h后還有80%以上的酶活力;80℃處理1 h后還有45%的酶活力［18］。國(guó)內(nèi)已報(bào)道根霉SFE－L01脂肪酶，該酶在30～60℃之間具有良好的熱穩(wěn)定性，在70℃處理70 min后還有62%的酶活力，80℃處理70 min后還有35%的酶活力［19］。

圖4 B－36產(chǎn)脂肪酶作用的最適溫度及酶的熱穩(wěn)定性

2.3.2 酶反應(yīng)的最適pH值和pH穩(wěn)定性

配制pH 2.0～8.0、間隔1個(gè) pH值單位的緩沖液，測(cè)相同酶液在不同pH值條件下的酶活力，結(jié)果如圖5a，該酶作用的適宜pH 4.0，可見該酶是一種酸性脂肪酶。對(duì)該酶進(jìn)行耐酸性試驗(yàn)，將酶液與不同pH 值(2.0 ～6.0)緩沖液以1∶3 的比例混合，40 ℃靜置1 h，再將酶液調(diào)回到最適pH值測(cè)酶活，用未經(jīng)處理的酶液作對(duì)照。結(jié)果如圖5b，該酶在酸性環(huán)境中保溫1 h后可保持70%以的酶活力，尤其在pH 4.0時(shí)可保持83.2%的酶活力，因此，說(shuō)明該酶在酸性條件下較為穩(wěn)定。目前，國(guó)外已報(bào)道pH穩(wěn)定性較好的耐酸性脂肪酶——嗜熱青霉(Mesophilic Penicillium)脂肪酶，該酶在pH 4.0～6.0之間比較穩(wěn)定，在pH 5.0時(shí)作用2 h后，仍能保持65%以上的酶活;80℃處理1 h后還有45%的酶活力［3］。國(guó)內(nèi)已報(bào)道地霉屬Galactomyces geotrichum FL002菌株產(chǎn)脂肪酶在pH 6.0～8.5 之間比較穩(wěn)定，在pH 6.0 時(shí)作用1 h后，仍能保持80%的酶活力［12］。

圖5 脂肪酶作用的最適pH及酶的pH穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子及EDTA對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

分別將酶液與 10 mmol/L的 Ca2+、K+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Mg2+和 EDTA 等體積混合，室溫下靜置1 h后測(cè)酶活，以未添加任何金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照，結(jié)果如圖6。Mg2+對(duì)脂肪酶的水解具有強(qiáng)烈的激活作用，使酶活力提高了2倍多;Ca2+、Mn2+、EDTA以及 Na+對(duì)酶有明顯的激活作用，F(xiàn)e3+、Cu2+及Zn2+對(duì)酶水解有較強(qiáng)的抑制作用，K+對(duì)酶幾乎沒(méi)有作用，初步判定該酶是金屬離子依賴酶。

圖6 金屬離子及EDTA對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從50余個(gè)土壤樣品中分離篩選到8株產(chǎn)酸性脂肪酶的菌株，對(duì)其中一株高產(chǎn)菌株B－36通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。對(duì)該菌株脂肪酶性質(zhì)研究結(jié)果可知:其適宜作用溫度為60℃，適宜作用pH 4.0，并且在60℃處理70 min中酶活力還保持在80%以上，說(shuō)明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性;同時(shí)該酶在酸性環(huán)境中保溫1 h后可保持70%以上的酶活力，尤其在 pH 4.0時(shí)仍保持83.2%的酶活力，說(shuō)明該酶在酸性條件下較為穩(wěn)定。與其他種類的脂肪酶相比，Klebsiella sp.B－36所產(chǎn)脂肪酶兼具耐熱和耐酸特性，具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力，可以作為微生物脂肪酶生產(chǎn)的出發(fā)菌株，為菌種改良或構(gòu)建高效脂肪酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

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