退熱貼對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔的解熱作用及機制研究※

● 高樹彬 田志偉 賈艷平 孫士丹 范小芳 陳賽斌 楊一民 陳四文

內(nèi)毒素(ET)是最常見的致熱源，其主要成分是脂多糖，是效應很強的發(fā)熱激活物，其致熱方式可能是刺激內(nèi)生致熱源的產(chǎn)生和釋放，傳入體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。穴位貼敷療法是以中醫(yī)臟腑經(jīng)絡理論為依據(jù)，將藥物貼敷于特定俞穴，使藥物經(jīng)俞穴滲透進入人體，由經(jīng)絡血脈透達全身，并通過藥物對俞穴的局部刺激以及經(jīng)絡傳導，以達到治病防病目的的一種內(nèi)病外治療法。現(xiàn)代研究認為，cAMP和AVP是調(diào)節(jié)體溫的介質(zhì)，抑制ET性發(fā)熱，參與熱限形成［1］。

本實驗旨在觀察退熱貼穴位敷貼法用于內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔的退熱療效，及其對下丘腦、腦脊液的cAMP和膈區(qū)AVP的影響，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 普通級新西蘭白兔，雄性，10～14周齡，體重 2 ～3kg，基礎直腸溫度 38.5℃ ～39.5℃［2］(廈門大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號:粵監(jiān)證字2005A002SCXK(粵)2003－0001)，實驗室溫度控制在20℃ ±2℃，分籠飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 細菌內(nèi)毒素國家標準品(160EU/支，廈門鱟試劑實驗廠)，泰諾林混懸滴劑(上海強生制藥有限公司，國藥準字H19990007)，退熱貼(廈門市中醫(yī)院制劑室提供)，兔精氨酸加壓素(AVP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、兔環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)，分析天平(北京海納興業(yè)科技有限公司，型號FA2004)，離心機(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司，型號2420型KUBOTA)，酶標儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號infiniteMT200)，獸用體溫計，勻漿儀。

2 方法

2.1 分組 將30只實驗兔隨機分為5組，每組6只，即:空白組;模型組;熱貼組;泰諾林組;退熱貼、泰諾林聯(lián)合組。

2.2 造模 用無熱源生理鹽水將內(nèi)毒素稀釋成10EU/ml，按內(nèi)毒素10EU/kg耳緣靜脈注射制造發(fā)熱模型。

2.3 給藥 空白組:生理鹽水1ml/kg耳緣靜脈注射;模型組:內(nèi)毒素10EU/kg耳緣靜脈注射;退熱貼組:將兔大椎、曲池穴位備皮，然后予內(nèi)毒素10EU/kg靜脈注射，30min后予退熱貼貼于大椎、曲池穴并固定;泰諾林組:內(nèi)毒素10EU/kg耳緣靜脈注射，30min后予泰諾林15mg/kg灌胃［3］;退熱貼、泰諾林組:將兔大椎、曲池穴位備皮，然后予內(nèi)毒素10EU/kg耳緣靜脈注射，30min后予退熱貼貼于大椎、曲池穴并固定后，速予泰諾林15mg/kg灌胃。

2.4 體溫測量 實驗前將兔置于兔固定架上，用數(shù)字溫度計每天適應3～4小時，待動物穩(wěn)定后開始測體溫。測溫時將溫度計探頭插入動物肛門內(nèi)約6cm，每10分鐘測1次，連測3次，取平均值為基礎體溫。

2.5 觀察指標 第一部分:各兔給藥完成后，即按前法給各兔測量體溫并記錄，每隔30分鐘測1次，連續(xù)觀察6小時。各組平均體溫變化曲線;最大體溫上升高度(ΔT/℃)。第二部分:下丘腦、腦脊液的cAMP含量及腹中膈區(qū)AVP的含量。第一部分實驗完成后，將兔繼續(xù)常規(guī)分籠飼養(yǎng)7天后再開始第二部分實驗［4］。各兔分組及給藥同上。注射內(nèi)毒素或生理鹽水1小時后，耳緣靜脈注射空氣10ml致死，斷頭，沿兩耳中線向前剪開皮膚，充分暴露頭枕部，用5號針頭沿硬腦膜易被刺破區(qū)域的上緣正中穿刺［5］，抽取腦脊液0.6ml入1ml試管離心20min(3000轉(zhuǎn)/min)，取上清，置－20℃冰箱保存?zhèn)錅y。抽取腦脊液后迅速剝離頭蓋骨取出全腦，于視交叉與灰結節(jié)間取下丘腦50mg，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2ml，充分勻漿后倒入5ml試管中，靜置 5分鐘后離心(3000轉(zhuǎn)/min，20min)，取上清，置－20℃冰箱保存?zhèn)錅y。同時將剩余腦組織置沸生理鹽水中煮沸5分鐘后，取腹中膈區(qū)腦組織30mg，加PBS 2ml，充分勻漿后離心(3000轉(zhuǎn)/min，20min)，取上清，置－20℃冰箱保存?zhèn)錅y。cAMP和AVP含量測定分別按其酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件包處理。測定數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。直線相關分析法判定兩變量間相關情況。

3 結果

3.1 樣品對平均體溫變化和最大體溫上升高度的影響 結果見圖1、表1，顯示:空白組體溫無明顯波動;模型組在給藥后1小時和5小時分別達到發(fā)熱高峰，呈明顯雙峰熱，△T明顯高于空白組(P＜0.01)，造模成功;其余三組的△T均明顯低于模型組(P＜0.05)，且聯(lián)合組與模型組的差異更顯著(P＜0.01)，退熱效果顯著。

3.2 樣品對下丘腦、腦脊液cAMP含量的影響 結果見表2，模型組均顯著高于空白組(P＜0.01)，其余三組均明顯低于模型組(P＜0.05)，且以聯(lián)合組更顯著(P＜0.01)。膈區(qū)AVP含量比較，模型組明顯高于空白組(P＜0.01)，退熱貼組明顯低于模型組(P＜0.05)，聯(lián)合組更顯著低于模型組(P＜0.01);而泰諾林組與模型組無明顯差異(P＞0.05)。

3.3 相關分析顯示 各組腦脊液的cAMP含量與體溫變化呈正相關(r=0.918，P＜0.05)，下丘腦的cAMP含量與體溫變化也呈正相關(r=0.883，P＜0.05)，腹中膈區(qū)AVP含量亦與體溫變化呈正相關(r=0.901，P ＜0.05)。

表1 各組最大體溫上升高度(△T)(n=6，±s)

表1 各組最大體溫上升高度(△T)(n=6，±s)

注:與空白組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 △T(℃)空白組0.013 ±0.083模型組 0.738 ±0.167△退熱貼組 0.588 ±0.106*泰諾林組 0.591 ±0.062*聯(lián)合組 0.366 ±0.121＊＊

表2 腦脊液和下丘腦的cAMP和膈區(qū)的AVP含量比較(n=6，±s)

表2 腦脊液和下丘腦的cAMP和膈區(qū)的AVP含量比較(n=6，±s)

注:與空白組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

cAMP(pg/ml)組別腦脊液 下丘腦腹中膈區(qū)AVP(ng/L)154.58 ±9.71 121.14 ±8.41 63.35 ±6.26模型組 220.50±20.64△△ 166.48±9.35△△ 99.92±11.36△△退熱貼組 182.26 ±7.35* 136.62 ±17.15* 86.59 ±4.96*泰諾林組 195.20 ±10.66* 148.20 ±12.78* 99.68 ±8.98聯(lián)合組 172.47±8.18＊＊ 133.34±10.57＊＊ 79.80±7.15空白組＊＊

4 討論

外治法在我國有著悠久的歷史，《理瀹駢文》云:“外治之理即內(nèi)治之理，外治之藥亦即內(nèi)治之藥，所異者法耳。”說明外治與內(nèi)治僅方法不同，而治療原則是一致的。中藥穴位貼敷的外治法因易被患者接受，在臨床也屬常用。

本實驗所用退熱貼藥物組成有羌活、白芷、細辛、川椒、赤小豆等，穴位選擇大椎、曲池。大椎穴是督脈、手足陽經(jīng)的交會穴，被稱為“諸陽之會”，能宣散一身陽熱之氣，主一身之表，具有通陽、解表、退熱、祛邪的作用。另外，因為其位于督脈通達上下的關鍵樞紐部位，大量的臨床及實驗研究［6］證實，大椎穴具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，不僅可使白細胞數(shù)量適度增加，更可使白細胞的吞噬能力得到增強，其啟動或激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用可能與其“通調(diào)督陽”的作用有關。曲池為手陽明經(jīng)之合穴，具有疏風清熱，調(diào)和營血的作用，為全身祛風退熱的要穴，無論熱邪在表，還是熱入陽明或熱在半表半里，本穴均有較好的作用。本研究精選中藥具有發(fā)散表邪，祛風散寒功用，其中羌活氣味雄烈，細辛芳香透達，《本草綱目》記載川椒屬純陽之物，其味辛而麻，諸藥氣味俱厚，貼敷于大椎、曲池穴，藥物功效加之所選穴位的特殊功用，共奏發(fā)散表邪、解風寒外束之功，達到激發(fā)正氣、提高機體的免疫力、退熱解表的作用，以助驅(qū)邪外出。

現(xiàn)代研究認為，發(fā)熱的體溫調(diào)節(jié)機制由正、負調(diào)節(jié)中樞兩部分組成。目前公認的正調(diào)節(jié)介質(zhì)有前列腺素E、Na+/Ca2+比值、cAMP、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素等。越來越多的研究證明cAMP是一種重要的中樞發(fā)熱介質(zhì)［7］，ET性發(fā)熱時，cAMP可引起體溫調(diào)定點上移，動物下丘腦、腦脊液中的cAMP明顯升高，與發(fā)熱效應呈明顯正相關。cAMP可能是最接近終末環(huán)節(jié)的發(fā)熱介質(zhì)。近些年來，中樞解熱介質(zhì)在發(fā)熱反應過程中的負調(diào)節(jié)機制越來越受到國內(nèi)外學者的重視。現(xiàn)已證實，參與體溫負調(diào)節(jié)的中樞解熱介質(zhì)主要有精氨酸加壓素(AVP)、促黑素細胞刺激素(a－MSH)及其他一些尿中的發(fā)熱抑制物。機體發(fā)熱時，腹中膈區(qū)和杏仁核分泌AVP增多，并作用于AVP受體V1，通過神經(jīng)系統(tǒng)傳導作用于神經(jīng)元，削弱ET引起的發(fā)熱效應［8］。腹中膈區(qū)的AVP含量下降，表明AVP的釋放增多，刺激腹中膈區(qū)的AVP的內(nèi)源性釋放而抑制發(fā)熱。

本實驗結果表明無論是退熱貼的單獨使用還是與泰諾林的聯(lián)合使用都對ET性發(fā)熱家兔有明顯的解熱作用，且以聯(lián)合使用效果更顯著。由此可推測，退熱貼的解熱機制可能是通過抑制cAMP的生成與釋放，同時刺激膈區(qū)AVP的內(nèi)源性釋放而抑制發(fā)熱，此雙方面的調(diào)節(jié)作用達到退熱效果。但本研究樣本量尚小，實驗條件有限，退熱貼和泰諾林聯(lián)合使用能否使退熱效果更穩(wěn)定，能否減少西藥的毒副作用等問題，有待進一步大樣本實驗研究和探討。

［1］李楚杰.發(fā)熱時體溫的正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)［J］.中國病理生理雜志，1994，10(5):553 －557.

［2］中國藥典［S］.二部，2010:附錄 XID.

［3］陳 奇，孫建寧.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:1167 －1172.

［4］杜 穎，黃清泉，賀爭鳴.家兔對細菌內(nèi)毒素致熱耐受性的實驗研究［J］.實驗動物科學與管理，2003，20(4):13 －15.

［5］富 宏，陶迎紅，王學美，等.經(jīng)皮穿刺延髓池抽取兔和大鼠腦脊液的方法［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16(11):684 －687.

［6］李曉泓.大椎穴免疫調(diào)節(jié)作用的研究概況［J］.中國臨床康復，2004，8(2):342 －343.

［7］金惠銘，王建枝.病理生理學［M］.第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.83 －90

［8］楊惠玲，潘景軒，吳偉康.高級病理生理學［M］.第1版.北京:北京科學出版社，1998:86－112.