環丙沙星對土壤微生物量碳和土壤微生物群落碳代謝多樣性的影響

馬 驛 ，彭金菊，王 蕓，陳法霖，陳進軍，孫永學

(1.廣東海洋大學農學院動物醫學系，湛江524088;2.中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室，北京100085;3.華南農業大學廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州510642)

近30年來，氟喹諾酮類(fluoroquinolones，FQs)的研究進展十分迅速，臨床常用的有諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星(Ciprofloxacin)等10多種藥物。FQs為廣譜殺菌藥(對細菌、支原體、衣原體等均有作用)，抗菌力強，被廣泛應用于人類及動物感染性疾病的治療。因FQs體內原型排泄率大，經人畜使用者排泄物進入環境中的范圍廣、量大。對北京污水及地表水測定結果顯示，污水中含有12種氟喹諾酮類抗生素，濃度12—1208 ng/L，地表水含7種FQs，濃度1.3—535 ng/L［1］。FQs化學性質較穩定，導致其環境殘留的抗菌生物活性時間相對較長，FQs在環境中持續地遷移擴散，對人類健康形成了不可預測的潛在風險［2］，Schwarzenbach等［3］稱FQs等新型污染物引起的微污染已成為“人類面臨的重大環境問題之一”。環丙沙星對植物的影響已有報道［4］。

土壤微生物量碳作為土壤有機質中最活躍和最易變化的組分，能在很大程度上反映土壤質量和土壤微生物數量，因而是評價土壤微生物量和活性的重要指標［5］。土壤微生物碳源利用率和碳代謝多樣性，能反映生態系統受干擾后的細微變化，是土壤生物肥力的重要指標，對土壤管理有重要的指示作用［6］。目前，重視分子生物學方法分析微生物群落功能多樣性，但分子生物學方法要求的勞動強度大、時間長、技術含量較高，難以在較短的時間內分析較多的樣品，以Biolog微孔板碳源利用為基礎的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、更為快速的方法［6-7］。土壤微生物對Biolog微平板中各類碳源的利用情況的差異反應了土壤中微生物群落代謝功能的不同，平均每孔顏色變化率(AWCD)是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標，反映了土壤微生物活性、微生物群落的反應速度和反應程度，已廣泛應用于評價土壤微生物群落的功能多樣性［8-10］。本試驗通過在土壤中添加不同濃度環丙沙星，借助氯仿熏蒸浸提法和Biolog法，分析土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性，明確土壤微生物群落碳代謝的變化方向和程度，了解環丙沙星對土壤微生物群落的影響強度，以揭示環丙沙星在環境中殘留對土壤微生物學性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤

培養土壤采自廣東海洋大學花園苗圃10—20 cm土層的土壤，為磚紅壤，土有機質28.5 g/kg，全氮1.82 g/kg，全磷1.31 g/kg，全鉀23.6 g/kg，速效磷14.5 mg/kg，速效鉀145 mg/kg，pH值6.75。

采集的新鮮土樣過4 mm篩，用濕紗布蓋于土表于室溫下放置3d，待微生物活化后，按每5 kg鮮土加入50 mL不同濃度的環丙沙星溶液(環丙沙星活性成分含量≥98.5%，浙江國邦獸藥有限公司)，使土壤中環丙沙星活性成分含量分別為:Ⅰ組(對照組)0μg/g、Ⅱ組0.01μg/g、Ⅲ組0.1μg/g、Ⅳ組1μg/g、Ⅴ組10μg/g、Ⅵ組100μg/g，用去離子水調土壤濕度至40%的飽和持水量，混合均勻后倒入10 L的塑料桶中，并用濕紗布蓋于土表，置于室溫(20—25℃)下培養35d，用稱重法每隔3d調節1次土壤濕度，以保持土壤濕度穩定，每個處理設3次重復。

1.2 分析項目及方法

1.2.1 土壤微生物量碳

于處理后21d采取相當于20 g烘干質量的培養土壤，用氯仿熏蒸浸提法測定土壤微生物量碳［11］。

1.2.2 BIOLOG分析

分別于用藥后7d、21d、35d采集新鮮土壤10 g，加90 mL滅菌生理鹽水(0.85%)，充分振蕩30 min后，稀釋至10-3倍，再吸取150μL接種到Biolog EcoPlate微平板的微池內，置于25℃下培養，每12 h在590 nm下BIOLOG讀數器上讀數。

平均每孔顏色變化率(AWCD)計算［12-13］:

式中，C為每個有培養基微池的光密度值，R為對照孔的光密度值，n為培養基數據，EcoPlate板中有31種不同碳源，n值為31。

采用曲線整合方法［14］估計碳源代謝強度:

梯形面積

式中，vi為i時刻的AWCD值。

豐富度指數為被利用的碳源的總數目，即31個微池中C-R值大于0.25的微池數［15］。多樣性指數用Shannon-Wiener指數(H')表示:

式中，Pi為有培養基的微池與對照微池的光密度值差與整板總差的比值。

即

本試驗采用Biolog微平板培養72h的數據，來比較土壤微生物群落的碳源利用及代謝功能多樣性，采用SPSS11.5軟件進行統計分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物量碳

用環丙沙星處理后21d土壤中微生物量碳含量如圖1所示，環丙沙星(0.1—100μg/g)對土壤微生物量碳含量影響顯著(與對照組比較，P＜0.5)，藥物處理組土壤微生物量碳含量均低于對照組，土壤中環丙沙星濃度愈高，土壤微生物量碳含量愈低。100μg/g的環丙沙星處理使土壤微生物量碳下降58.69%。

2.2 土壤微生物群落碳代謝多樣性

AWCD是反映土壤微生物活性，即利用碳源的整體能力的一個重要指標［16］。由圖2可知，微生物活性隨培養時間的延長而提高，不同組別土壤微生物利用單一碳源能力的大小順序為:Ⅰ組＞Ⅱ組＞Ⅲ組＞Ⅳ組＞Ⅴ組＞Ⅵ組。處理后7、21、35d，各處理組土壤微生物的AWCD基本都低于對照組，尤其是Ⅵ組(100μg/g組)降低了56.56%—78.94%。

培養基豐富度指數反映的是微生物利用碳源的數量，培養基Shannon-Wiener多樣性指數表明的是土壤微生物群落利用碳源類型的多與少，即功能多樣性。土壤微生物群落代謝功能豐富度指數和多樣性指數與藥物濃度的變化情況(表1)為:

第7天，對照組的豐富度指數與0.1、1、10、100μg/g組差異顯著;第21天、35天，100μg/g組的豐富度指數與對照組差異顯著。

第7天、21天，對照組的多樣性指數與10、100μg/g組差異顯著;第35天，對照組的多樣性指數與其他各組之間差異不顯著。

2.3 土壤微生物對碳源的利用強度

AWCD曲線的積分面積反映了土壤微生物群落在Biolog微平板整個培養期內利用碳源能力的差異，本研究采用AWCD曲線整合方法估計土壤微生物群落的代謝強度。環丙沙星含量不同，土壤微生物對碳源的利用強度不同(圖3)，第7天，對照組土壤微生物對碳源的利用強度最大，與用藥各組均差異顯著;第21天、35天，10、100μg/g組土壤微生物對碳源的利用強度與對照組差異顯著。

圖1 處理后21d土壤微生物量碳含量Fig．1 Contents of soil microbial biomass carbon(MBC)for each treatment after 21 days

圖2 處理后7d土壤平均顏色變化率Fig．2 Average well colour development in soil from different treatments after 7 days

表1 土壤微生物利用Biolog微平板碳源的豐富度指數和多樣性指數Table1 Richness indexes and diversity indexes of utilized substrates for each treatment

2.4 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

31種碳源的測定結果形成了描述微生物群落代謝特征的多元向量，不易直觀比較，對31種碳源進行主成分分析結果表明:土壤微生物群落的代謝多樣性類型分異明顯。第7天(圖4)，第一主成分和第二主成分得分系數的差異均達顯著水平(P＜0.05)，土壤中環丙沙星wCIP≥0.01μg/g與對照組差異顯著;第21天，第一主成分和第二主成分得分系數的差異均達顯著水平(P＜0.05)，土壤中環丙沙星wCIP≥1μg/g與對照組差異顯著;第35天，第一主成分得分系數的差異達顯著水平(P＜0.001)，土壤中環丙沙星wCIP=100μg/g與對照組在主成分1上差異顯著。

2.5 不同處理土壤微生物對6類碳源的利用率

試驗用31種碳源可分為6類，對6類碳源分別計算，其平均吸光值可直接反映土壤微生物對不同碳源的利用率。第21天，各組的土壤微生物對6類碳源的利用情況存在差異(表2)。藥物處理組碳水化合物、羧酸、氨基酸、聚合物、酚類和胺類的平均吸光值均低于對照組，100μg/g組土壤微生物對6類碳源的平均吸光值均與對照組差異顯著。

圖3 不同濃度環丙沙星處理下土壤微生物群落利用碳源的強度Fig．3 Carbon metabolic intensity of soil microbial communities for each treatment

圖4 處理后7d土壤微生物群落主成分分析Fig．4 Principal components analysis on soil microbial communities from different treatments after 7 days

表2 處理后21d土壤微生物對6類碳源的平均吸光值Table2 Average well color development of soil microbes from six carbon sources after 21 days

3 討論

土壤微生物是土壤養分循環的推動力，土壤中的一系列過程以碳、氮循環為中心，土壤微生物量碳是評價微生物量和活性參數的重要指標，也是評價土壤碳庫平衡和土壤化學、生物化學肥力保持的重要指標。試驗結果表明，環丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)使土壤微生物量碳含量顯著降低，環丙沙星是通過干擾菌體DNA的復制而發揮特異性抗菌作用，對靜止期和生長期的細菌均有效，對支原體、大腸桿菌、巴氏桿菌、丹毒絲菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、克雷伯氏菌、彎曲桿菌、氣單胞菌屬、嗜血桿屬、弧菌屬、變形桿菌、布氏桿菌等均有良好的抗菌作用，對部分真菌和放線菌也有抑制作用。環丙沙星使土壤微生物的數量和活性大大降低，所以土壤微生物量碳也減少。

試驗結果表明，土壤中環丙沙星濃度愈大土壤微生物利用碳源的能力愈低，微生物群落碳代謝功能多樣性也愈低。0.1、1、10μg/g的環丙沙星處理對土壤微生物群落代謝功能的影響主要體現在用藥第7天、21天，100μg/g的環丙沙星處理在用藥7、21、35d均顯著影響土壤微生物群落。實驗結果與恩諾沙星對土壤微生物的碳源利用及代謝功能多樣性影響的結果一致［17］，用藥3、14d，恩諾沙星含量0.1—100μg/g使土壤微生物群落代謝功能多樣性顯著降低(P＜0.05);第35天，恩諾沙星含量10—100μg/g使土壤微生物群落代謝功能多樣性顯著降低。原因是多方面的，首先，土壤是一個復雜的生態體系，任何一個生態系統的發展變化都是多因素綜合作用的結果，各種理化因子如土壤含水量、溫度、pH值、有機質、無機質等均能對環丙沙星的稀釋、水解、氧化等降解作用有一定影響;其次，各種礦物質尤其是Mg2+、Ca2+等金屬離子可與環丙沙星發生鰲合，加上土壤對藥物的吸附作用不利于藥物的解離，致使土壤中實際藥物濃度降低［18］;另外，土壤中微生物、原蟲等土壤生物種類繁多，有些微生物對環丙沙星不敏感，所以微生物也能降解土壤中的環丙沙星，從而逐漸恢復土壤微生物生態平衡。因此，低濃度藥物組的土壤微生物群落碳代謝功能多樣性與對照組之間的差異變得不顯著。但環丙沙星化學性質穩定，在環境中降解緩慢［19］，污水處理廠污泥中環丙沙星的含量達1.96 mg/kg，將這種污泥施入土壤8個月后，環丙沙星含量為0.32 mg/kg，21個月后含量為0.3 mg/kg［20］，如果藥物在土壤中長期殘留，其對生態環境的影響不容忽視。

金彩霞［3］等研究了環丙沙星對作物發芽的生態毒性效應，環丙沙星抑制小麥、白菜、番茄的種子發芽率、根伸長和芽伸長，本研究表明環丙沙星影響土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性。獸藥進入生態環境后，不僅對陸生植物、土壤微生物造成影響，還影響土壤動物、原生生物，以及水生生物中的浮游類生物、微生物、魚蝦及水體甲殼動物等［21-23］。為了確保生態環境安全，應加強獸藥安全使用，結合獸藥暴露與效應兩方面進行環境風險評估尤其重要［24］。

4 結論

環丙沙星對土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的增高而影響加大。本研究結果表明，環丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)顯著降低土壤微生物量碳含量、土壤微生物對各類碳源的利用率、土壤微生物碳代謝強度和代謝多樣性，其中100μg/g的環丙沙星處理影響最大，使土壤微生物量碳下降58.69%，土壤微生物利用單一碳源能力降低56.56%—78.94%。同時，環丙沙星對土壤微生物群落碳代謝多樣性的抑制作用還表現出時間差異，0.1、1、10μg/g的環丙沙星處理對土壤微生物群落碳代謝功能的影響主要表現在處理前期(用藥第7天、21天)，這種影響在處理后期(用藥第35天)表現不明顯，100μg/g的環丙沙星在用藥的前期和后期均顯著影響土壤微生物群落碳代謝功能。

致謝:本研究在中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室完成，謹致謝忱。

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