春季海南島近岸海域尿素與浮游生物的脲酶活性

黃凱旋，張 云，歐林堅，* ，呂頌輝，呂淑果，齊雨藻

(1.暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心，水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室(暨南大學)，廣州 510632;2.海南省環境科學研究院，海口 570206)

過去的幾十年間，作為一種重要的氮肥，尿素的使用量在全球范圍內增加了100倍，中國和印度作為農業大國，尿素的使用量占到全球的一半［1］。由于尿素的過量使用，大量未被利用的尿素通過徑流等方式進入沿海海域，從而導致近岸和河口水體中尿素含量大幅度升高［1-3］。尿素作為一種小分子有機氮源，可以被浮游植物直接吸收利用，在海洋氮循環中可能發揮重要作用［1，4］。然而，在很長的一段時間內，包括尿素在內的有機氮源對海洋初級生產力的貢獻都被忽視了。水體中浮游植物對尿素的吸收率范圍為0.1—3.6μmolN/h，有可能高于對無機氮的吸收率，占浮游植物對氮吸收的50%以上［5］。海區中尿素濃度較低，大洋中尿素濃度通常檢測到的濃度為摩爾濃度，而近岸、河口和河流中尿素濃度變化極大，范圍為0.02—23.40μmolN/L［1］。尿素并非海洋調查中的常規監測項目，目前對于全球(包括我國)大多數海區中尿素濃度的分布及生物可利用狀況知之甚少。

在浮游植物細胞內，尿素主要通過脲酶作用水解為NH+4和CO2，隨后進入各種生化代謝途徑［6］。有研究表明，不同種類的浮游植物在利用尿素的能力上存在差異，海水中尿素濃度的增加可能有利于某些類群的生長，如藍細菌、甲藻等［7-8］。越來越多的研究發現尿素的輸入與有害藻華的發生存在一定的相關性［9-10］。近岸和河口水域尿素的可利用性及其對浮游生物群落的影響已成為新的研究熱點［11-12］。

海南省位于我國最南端的南海海域，海水潔凈，總體水質良好。但近年來，隨著海南經濟的發展，大量工農業廢水和生活污水直接或間接排入海洋，導致近岸海區富營養化程度加劇，有害藻華頻發，且規模不斷擴大［13-14］。赤潮多發生在2—5月間，海口、澄邁、文昌、陵水和三亞沿海一帶海域是海南赤潮監控的重點區域［15］。2011年春季(4—5月)，研究者對上述5個區域開展調查采樣，重點研究水體中的尿素濃度及浮游生物的脲酶活性的水平分布狀況，結合相關的理化環境數據，分析海南島近岸海域尿素的可利用性及其對浮游植物種群生長、種間競爭可能產生的影響，為研判該海域海水的污染程度及赤潮的發生機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 站位布設與采樣時間

調查區域包括5個海灣，分別為位于北部的海口灣(5個測站)和澄邁灣(6個測站)，位于東部的文昌八門灣(8個測站)，位于南部的陵水新村灣(6個測站)、大東海(6個測站)(圖1)。海口灣位于海口市北部，海灣面積43.7km2，海口市生活污水以及部分工業廢水由龍昆溝和秀英溝排污口直接或間接排入海域，并有來自海口新港和海甸溪入海口等的污染物，海口灣近岸海域富營養化程度高。澄邁灣為澄邁縣北部海灣，海灣面積16km2，澄邁灣近岸擁有萬噸深水泊位碼頭，并有大量重工業落戶于馬村港，澄邁灣面臨著很大的環境壓力，部分水體出現富營養化。文昌八門灣位于海南省東部，銅鼓嶺淇水灣海域分布數千畝養蝦池，為海南省重要的養殖基地。位于南部的陵水新村灣為天然瀉湖性港灣，西部有一窄口與陵水灣想通，集漁港、海水養殖、濱海旅游和居住區為一體。大東海地處海南省最南端，近年來隨著旅游業的興起和養殖業的不斷擴大，沿海一帶的的水質呈現輕度污染狀態。澄邁灣、陵水新村灣和文昌八門灣的采樣時間為2011年4月26日，海口灣為2011年4月29日，大東海為2011年5月25日。

1.2 調查項目及方法

水溫和鹽度由美國YSI 6600V2現場監測。總溶解態氮(TDN)、硝酸鹽()+亞硝酸鹽()、總溶解態磷(TDP)和磷酸鹽(DIP)濃度采用荷蘭Skalar San++連續流動分析儀測定。銨鹽()按照《海洋調查規范》［16］測定。溶解無機氮(DIN)=++，溶解有機氮(DON)=TDN-DIN，溶解有機磷(DOP)=TDP-DIP。

浮游植物的采集、固定和計數均按《海洋調查規范》［16］執行，在日本Olympus BX61光學顯微鏡下進行浮游植物種類的鑒定和定量計數。

尿素含量的測定仿照Revilla等［8］的方法。現場海水經煅燒過的GF/F膜(450℃，3 hr)過濾，凍存。樣品檢測時，取水樣各4 mL分裝入4個檢測試管中，其中2只各加入1.2 mL顯色試劑，另2只各加入1.2 mL空白對照試劑。(22±2)℃的黑暗環境下渦旋振蕩72 hr，在韓國Mecasys Optizen 2120UV分光光度計520 nm波段下檢測。所得尿素含量以μmol/L表示。

脲酶活性的測定以Solomon等［6］的方法為基礎進行優化。浮游植物顆粒經100μm孔徑篩絹過濾后，采用GF/F濾膜收集，液氮中保存。在濾膜樣品上加入1 mL勻漿抽提液，冰浴條件下破碎研磨細胞，離心后取上清液分別轉移至檢測試管tf及對照管t0中，加入脲酶反應緩沖液。在tf管中加入尿素儲備液(N終濃度為5 mmol/L)，20℃水浴下反應1 h，對照組t0管在水浴反應前既沸水滅活處理。待樣品冷卻至室溫后，加入苯酚溶液，按照NH+4的方法在韓國Optizen 2120UV分光光度計640 nm波長下檢測樣品。脲酶活性以μmolN·L-1·h-1表示。

圖1 海南島監測區域與測站位布設Fig．1 Monitoring areas and stations in Hainan Island

1.3 數據分析處理

使用SPSS17.0軟件進行數據統計分析:1)不同海灣間同一理化環境參數的差異性采用單因素方差分析方法(ANOVA);2)理化環境參數對浮游生物脲酶活性和浮游植物細胞密度的影響，采用stepwise回歸相關性分析法，其中北部海區甲藻細胞密度與各參數的stepwise分析無法建立回歸方程，進而采用Enter回歸分析法;3)對不同理化環境因子進行主成分分析，并對5個海灣不同理化參數進行聚類分析。

2 結果

2.1 不同海灣理化環境因子的變化

海南島北部近岸海域(海口灣、澄邁灣)水溫顯著低于南部海域(陵水新村灣、大東海)(P＜0.01)(表1)。各海灣鹽度范圍32.6—34.0，無明顯差異(P＞0.05)。DIN表現出由南向北遞增，除個別海灣站位外，硝酸鹽含量占DIN含量的90%以上。海口灣富營養化最為嚴重，其DIN、DIP含量明顯高于其它海灣(P＜0.05)。各海灣海水的營養鹽組成與結構存在區別。海口灣和大東海水體中的DIP含量較高，達到二、三類標準，大東海部分海區呈無機磷污染，該海區平均DIN/DIP為6，可能存在氮限制。在澄邁灣和文昌八門灣，絕大多數測站的DIP均低于檢出水平，有機磷源占據主要成分，達52%以上，海區存在潛在的磷脅迫或限制。

對不同理化環境因子進行主成分分析，提取到5個主成分累計貢獻率為79.58%。5個主成分分別為DIN、DOP、DON、浮游植物細胞密度和鹽度，可見除外無機氮外，有機氮和有機磷濃度是海南省近岸海域較為重要的營養鹽指標。5個海灣的聚類分析表明，文昌八門灣和陵水新村灣的理化環境因子狀況相似程度最為接近，這可能與文昌八門灣和陵水新村灣同為海南省重要的養殖基地有關。

表1 春季海南島近岸海域不同海灣環境理化因子比較Table 1 The comparison of physical and chemical factors of different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring

2.2 不同海灣尿素濃度分布及其對氮源與浮游植物生長的貢獻

海南島近岸海域中尿素濃度平均值范圍為2.07—3.30μmol/L，占TDN含量的14%—38%，且尿素占TDN比例由北向東南方向升高(表2)。如圖2所示，各海灣較高水平的尿素濃度主要分布在排污口、養殖區或旅游區的近岸海域。尿素濃度較高的水體中發現甲藻細胞密度達到104—105個/L的水平，細胞密度高于一般水體。

表2 春季海南島近岸海域不同海灣尿素濃度、脲酶活性與浮游植物豐度比較Table 2 The comparison of urea concentrations，urease activities and phytoplankton densities in different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring

澄邁灣尿素平均濃度及占TDN比例均低于其它海灣，2號測站馬村港出海口的尿素濃度最高，為6.16 μmol/L，在該站測站的甲藻細胞密度也最高，達1.65×104個/L。海口灣尿素平均濃度高于其它海灣。7號測站海甸溪至8號測站龍昆溝入海口近岸海域尿素濃度較高，其中龍昆溝浮游植物細胞密度高達18.32×106個/L，同時發現甲藻細胞密度達到1.20×104個/L，其它站點的甲藻數量非常少。文昌八門灣尿素占TDN含量的11—38%，13號測站清瀾港通航水道和淇水灣近岸海域尿素濃度較高，范圍為3.23—3.34μmolN/L，甲藻細胞密度范圍為104—105個/L。陵水新村灣尿素濃度變化范圍0.62—5.28μmolN/L，其中新村灣養殖網箱附近的21號測站和24號測站出海口外尿素濃度最高。21號測站尿素濃度甚至高于硝酸鹽，占TDN含量49%，在該站，檢測到錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea(Stein)Loeblich)密度達到104個/L，其它測站甲藻數量少。大東海尿素和NO-3平均濃度均為2.24μmolN/L，多個測站的尿素濃度高于硝酸鹽，尿素占TDN的比重高于其它海灣，大東海海域甲藻種類最多且平均密度也高于其它海灣。在26、27測站，尿素濃度占TDN的30%以上，這2個測站出現的甲藻種類較多，密度達到104—105個/L。

2.3 不同海灣浮游生物脲酶活性分析

春季，海南島浮游生物脲酶活性為0.30—0.84μmolN·L-1·h-1，海口灣最高，從北部向東、南部逐漸減少(表2，圖3)。在澄邁灣，3號測站東水港出海口脲酶活性較高，達到0.76μmol·L-1·h-1。海口灣龍昆溝出海口脲酶活性最高，達1.63μmolN·L-1·h-1。龍昆溝為海口市生活污水的排污口，近岸水體污染嚴重，無機營養鹽及尿素含量均為高值，浮游植物包括甲藻細胞密度均為海口灣最高。文昌八門灣脲酶活性最高點出現在13號測站，達0.86μmolN·L-1·h-1，13號站不僅尿素濃度較高，DOP濃度為該灣最高值，達0.78μmol/L。新村灣脲酶活性和浮游植物細胞密度均高于陵水灣，脲酶活性與細胞密度相關性顯著(R2=0.82，P＜0.05)。新村灣養殖區水域的脲酶活性最高，21號測站TDP濃度、浮游植物包括甲藻細胞密度均為陵水新村灣最高。大東海紅沙灣附近水域脲酶活性范圍為0.54—1.16μmolN·L-1·h-1，其中30號測站尿素和DIP濃度高，DIP濃度達0.67μmol/L。

理化環境參數對海南省浮游生物脲酶活性的回歸分析顯示，海南省浮游生物脲酶活性和細胞密度、鹽度和DIN的相關性顯著(R2=0.97，P＜0.01)，5個海灣的脲酶活性97%的變化由細胞密度、鹽度和DIN引起。北部海區(海口灣和澄邁灣)脲酶活性94%的變化由浮游植物細胞密度決定，兩者的相關性極其顯著(R2=0.94，P＜0.01)。在南部海區(陵水新村灣和大東海)，鹽度和DOP濃度可解釋77%的脲酶活性變化(R2=0.77，P＜0.05)。浮游生物脲酶活性的分布與尿素的情況類似，在排污口、養殖區或旅游區的近岸海域，脲酶活性水平較高，這些水體的氮、磷濃度或細胞密度的水平也較高。

圖3 春季海南近岸海域脲酶活性(μmol·L-1·h-1)分布圖Fig．3 The distribution of urease activities in different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring U:低于檢測限

2.4 浮游植物生長分布與海區理化因子的相關性分析

海南島近岸海域浮游植物群落以硅藻為優勢種，各海灣浮游植物平均細胞密度達到106個/L以上。文昌八門灣18號測站和陵水新村灣水體以擬菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.)為優勢種，細胞密度達到106—108個/L;其它海灣的優勢種主要為骨條藻(Skeletonema spp.)和短角彎角藻(Eucampia zodiacus)。春季甲藻種類少細胞密度低，密度為104—105個/L的水體中其尿素和脲酶活性也處于較高水平。尿素可能在一定程度上促進近岸海域甲藻的生長，對浮游植物種群結構的變化存在影響。如表3所示，該海區浮游植物細胞密度主要由脲酶活性或尿素占TDN比例所決定，北部海灣甲藻細胞密度也主要受脲酶活性的影響。DON與甲藻細胞密度相關性顯著，對海南島甲藻的生長繁殖的作用較為重要。由此可見，海南浮游植物包括北部的甲藻可能更多的受到脲酶，進而是尿素的影響，南部甲藻則主要受到和DON的影響。

表3 春季海南近岸海域浮游植物細胞密度與相關理化因子的多元線性回歸分析Table 3 The regression analysis of phytoplankton densities and the relevant environmental factors in the coastal waters of Hainan Island during spring

3 討論

不同種類的浮游植物在利用尿素的能力上存在差異，甲藻單位細胞內的脲酶活性高于硅藻等其它種類。海區中尿素濃度的升高，不僅為浮游植物提供了更多的氮源，刺激初級生產力，還可能有利于鞭毛藻(包括甲藻)而非硅藻的生長，浮游植物的種群結構因此發生改變，從而引發種群的演替［1，12］。硅藻細胞的大量繁殖與水體中含量成正相關性，而鞭毛藻(包括甲藻)更適應低N，高 N、尿素和 DON 的環境［19，21］。在文昌八門灣出現高密度擬菱形藻的水體中，所測脲酶活性較低，可能與擬菱形藻吸收利用尿素的能力和細胞內的脲酶活性不高有關。海南春季以硅藻為優勢種，相對于硅藻，甲藻種類少細胞密度低，有些海區監測不到甲藻，而在甲藻細胞密度達到104—105個/L水平的水體中發現其尿素和脲酶活性均處于較高水平。大東海硝酸鹽濃度較低，部分海區尿素濃度高于硝酸鹽，尿素占TDN的比重高于其它海灣。在大東海海域的水體發現，甲藻種類最多且平均密度高于其它海灣。多元回歸分析表明，海南島DON對甲藻細胞密度有著較為重要的影響，北部海灣甲藻生長可能主要受到尿素的影響，而南部甲藻細胞密度則與N和DON關性顯著。

4 結語

2011年春季，對海南島的海口灣、澄邁灣、文昌八門灣、陵水新村灣和大東海5個海灣開展調查研究，得出以下結論:1)海南島近岸水體中以硝酸鹽為主要氮源，尿素平均濃度為2.07—3.30μmolN/L，高于NH+4濃度，占TDN含量的14%—38%，尿素占TDN比例由北向東、南方向加重遞增。2)浮游生物脲酶活性為0.30—0.84μmolN·L-1·h-1，海口灣最高，從北部向東、南部逐漸減少。各海灣較高水平的尿素和脲酶活性主要分在排污口、養殖區或旅游區的近岸海域。3)海南春季以硅藻為優勢種，甲藻種類少且細胞密度低，部分甲藻細胞密度達到104—105個/L的水體，尿素和脲酶活性也處于較高水平。尿素在一定程度上促進春季海南島近岸海域甲藻等浮游植物的生長，可能對浮游植物群落結構的改變產生重要影響。

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