反相高效液相色譜法測定O/W型二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素含量＊

王 熒 ，馬玉樊 ，盧婷利 ，陳 濤 ，2，3

(1.西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072; 2.陜西脂質體工程技術研究中心，陜西 西安 710075;3.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 710075)

青蒿素是從菊科植物黃花蒿中提取分離的一種有效的新型倍半萜內酯化合物，具有過氧橋結構。二氫青蒿素由青蒿素C－10羰基還原得到[1]，具有快速、高效、低毒性的特點，同時可以預防和治療血吸蟲病，抗腫瘤及皮膚病等多種疾病，是值得開發且具有良好應用前景的中藥品種[2－7]。但由于其水溶性差、生物利用度低，目前研究的新型載藥體系如脂質體、微球并不能增強二氫青蒿素的抗瘧效果[8－12]。因此，為提高二氫青蒿素的生物利用度及其抗瘧效果，筆者將二氫青蒿素包封于脂肪乳油相中，制成O/W型脂肪乳劑，且采用反相高效液相色譜法測定二氫青蒿素脂肪乳制劑中二氫青蒿素的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀，包括Waters2996型紫外檢測器，Waters 717型自動進樣器，WatersMillennium色譜工作站;實驗型高壓均質機NS 1001L型(意大利Niro Soavi)。二氫青蒿素對照品和原料(陜西匯生醫藥科技有限公司，對照品含量高于99%，制劑原料含量98%);國產精制蛋黃卵磷脂(西安力邦制藥有限公司，PC含量85%)，大豆油、甘油和維生素E等其他試劑為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。二氫青蒿素脂肪乳(1 g/L)、空白脂肪乳為自制品。

2 方法與結果

2.1 二氫青蒿素脂肪乳制備

取精制大豆油10 g，加入1.2 g精制蛋黃卵磷脂、維生素E 0.2 g和二氫青蒿素 0.1 g，加熱攪拌約 10～20min，混勻。另取注射用水 70mL，加入甘油 2.25 g、F68 2.6 g、油酸鈉 0.1 g。在氮氣保護和攪拌條件下，將油溶液緩慢加入水溶液中，調節總量至100mL。于高壓均質機中均質10min，均質壓力為850 bar，得到的二氫青蒿素脂肪乳的粒徑為150～250 nm，調節pH 6.0～8.5，過濾，分裝，通入氮氣，密封。121℃滅菌15 min，燈檢合格后，包裝。合格的乳劑應該是均勻的乳狀溶液，沒有沉淀、分層和飄油現象。試驗用空白脂肪乳即不含藥物的脂肪乳按照同樣工藝制備，并同在室溫保存。

2.2 溶液制備

精密稱取二氫青蒿素對照品10.0mg，置10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并定溶至刻度，搖勻，0.22μm濾膜過濾，即得1 g/L的對照品溶液。精密量取二氫青蒿素脂肪乳100μL，加無水乙醇溶解并定溶至3mL，搖勻，0.22μm濾膜過濾即得供試品溶液。精密量取空白脂肪乳100μL，加無水乙醇溶解并定溶至3mL，搖勻，0.22μm濾膜過濾，即得陰性對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agilent HC －C18柱(250mm × 4.6mm，5μm);流動相:乙腈 － 水(60∶40，V ∶V);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:216 nm;進樣量:20μL。

2.4 方法學考察

干擾試驗:取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液分別進樣，對照品和供試樣品溶液中二氫青蒿素色譜峰保留時間和峰形完全相同，而陰性對照品溶液在此保留時間內無干擾(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密稱取二氫青蒿素對照品5.5mg，置10mL的棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.55 g/L的二氫青蒿素貯備液。將此貯備液用無水乙醇半數稀釋成質量濃度分別為 0.275，0.137 5，0.068 75，0.034 375，0.017 187 5，0.008 59，0.004 29 g/L 的待測溶液，各進樣 20 μL，于216 nm波長處測定，以吸收峰面積 A×10－4為縱坐標、二氫青蒿素質量濃度 C(g/L)為橫坐標進行回歸分析，得標準曲線A=535542C－1533.5，r=0.9997(n=7)，線性范圍為 0.002129～2.18 g/L，定量下限為 0.002 129 g/L。

精密度試驗:取質量濃度為0.1 g/L的對照品溶液，依法連續重復進樣6次。結果二氫青蒿素平均峰面積為452 948，RSD=0.4%(n=6)，表明進樣精密度良好。

重復性試驗:取同一批號的樣品，分別按2.2項下方法制備6份對照品溶液和供試品溶液，分別進樣20μL，以外標法分別計算含量。結果二氫青蒿素的 RSD為2.8%，表明方法重現性良好。

穩定性試驗:精密量取同一供試品溶液20μL，室溫下放置，分別于 0.5，1，2，4，8，24 h 時進樣，記錄峰面積。結果二氫青蒿素的 RSD為0.23%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗:分別精密稱取素對照品 15，1.5，0.045mg，置于10mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，從中取1mL，加入100μL空白脂肪乳，混合均勻后按2.2項下方法操作，分別進樣20μL并記錄峰面積，由回歸方程計算回收率。結果見表1。二氫青蒿素、平均回收率為 95.33%，RSD 為 1.40%(n=9)。

2.5 樣品含量測定

精密吸取3個不同批次(111025，111026，111027)的樣品依2.2項下方法稀釋，于216 nm波長處檢測，用標準曲線法計算樣品含量，每個樣品測定3次。結果見表2。

3 討論

由于二氫青蒿素在210 nm波長處吸收較弱，干擾性強，很難準確測量。二氫青蒿素在216 nm波長處也有較強吸收，且色譜峰分離良好，故選擇檢測波長為216 nm。同時，由于二氫青蒿素在有機溶液中是以α異構體和β異構體兩種構型平衡存在，在溶解初期，主要是β異構體峰，隨著放置時間的增加，β異構體峰逐漸減少，α異構體峰逐漸增大，最后達到一對相對平衡狀態。因此，在檢測二氫青蒿素脂肪乳中二氫青蒿素含量時，將216 nm波長下α異構體峰和β異構體峰峰面積之和記錄為峰面積。

查閱有關文獻，曾考察了甲醇－水(60∶40)、乙腈－水(55∶45)、乙腈－水(60∶40)等不同比例的流動相系統，當流動相為甲醇－水、乙腈－水(55∶45)時，α峰與β峰較難分離;流動相為乙腈－水(60∶40)時，α峰與β峰得到滿意分離，故選擇流動相為乙腈 －水(60∶40)。

在檢測樣品中所含藥物的含量時，需要先將脂肪乳破乳，再進行高效液相色譜檢測。因為破乳不完全會干擾檢測結果，故考察了甲醇、異丙醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等破乳劑的效果:用甲醇破乳時需要用50倍的甲醇稀釋二氫青蒿素脂肪乳樣品，使得稀釋完溶液中藥物的含量很低，不利于檢測;用異丙醇、DMSO破乳時用30倍稀釋后能得到澄清的溶液，但是加入流動相會變渾濁，說明破乳仍不完全;用乙醇破乳時稀釋30倍后溶液變澄清，加入流動相時仍然澄清，說明破乳完全，故最終選擇乙醇為破乳劑。

本試驗將二氫青蒿素包封于脂肪乳中，將脂肪乳注射液作為一種胃腸外能量補給劑和油溶性藥物遞藥載體[13－14]。一方面，可抑制鐮狀瘧原蟲、惡性瘧原蟲的生長，抑制惡性瘧原蟲生長的半數致死量(IC50)值為8.07 g/L;另一方面還可降低維生素E的水平、增加亞麻酸的含量，從而增強抗瘧作用[15－19]。同時，它能為瘧疾患者提供營養，改善營養不良患者的淋巴細胞活性，有助于患者抵抗瘧疾和康復。本試驗中建立了反相高效液相色譜法測定O/W型二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素的含量，回收率與精密度高，重現性好，可用于二氫青蒿素脂肪乳劑中二氫青蒿素含量的測定。

表1 二氫青蒿素加樣回收試驗結果(n=9)

表2 樣品含量測定結果(標示量的%，n=3)

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