虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量標準值與不確定度評估分析方法研究

劉淑聰，張寶喜，楊世穎，馬 林，呂 揚

(北京協和醫學院·中國醫學科學院藥物研究所，藥物晶型研究中心，晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

虎杖為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖及根，主要有效成分為蒽醌類及芪類化合物，具有清熱解毒、利膽退黃、祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，屬常用中藥材品種[1]。中藥材的質量控制一直是困擾中藥研究與應用的技術難點和重點科學問題，而其中應用到的多種儀器技術與分析方法尚缺少大量的科學實驗和數據加以驗證。因此，中藥有效、定量、準確的質量控制技術和方法屬我國亟待解決的重要科學問題。國際上對藥品質量控制的趨勢已從僅提供藥物的有效成分含量值，發展到需要提供藥物有效成分的標準值和不確定度值，即將藥品的一般標準提升為計量標準，以保證藥品質量控制的量值溯源性和準確性。雖已有文獻對中藥材虎杖成分含量的報道，但目前尚未見關于其成分含量標準值和不確定度評估方法的報道。現將國際計量標準研究引入到對我國中藥復雜體系成分的含量研究中，通過國家一級有證計量標準物質虎杖苷化學純度標準物質(GBW09566)、白藜蘆醇化學純度標準物質(GBW09536)的量值傳遞，實現對中藥材虎杖中兩種成分的含量標準值及不確定度評價研究，旨在對我國現有分析技術和方法進行補充和完善。本研究中選用的安徽產虎杖中藥材，經質量檢查符合2010年版《中國藥典(一部)》的要求[2]，研究方法則依據《中華人民共和國計量法》《一級標準物質研制技術規范》(JJF1006－1994)及《標準物質管理辦法》等[3－5]相關技術文件的要求。現報道如下。

1 儀器和試藥

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器、Agilent chemstation工作站;Mettler XS105型分析用天平(感量0.01mg);SHH.W21.420型三用電熱恒溫水箱(北京精科華瑞儀器有限公司)。國家一級標準物質:虎杖苷化學純度標準物質，編號為 GBW 09566，純度標準值及不確定度值為(99.6±0.7)%(k=2，P=0.95);白藜蘆醇化學純度標準物質，編號為GBW09536，純度標準值及不確定度值為(99.4 ±0.5)%(k=2，P=0.95)。虎杖中藥材，產地安徽，經中國醫學科學院藥物研究所馬林教授鑒定為正品，樣品經除塵、粉碎、并過50目篩，備用;精密稱取1 g樣品，置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成了500支最小包裝1 g量的中藥材虎杖成分分析標準物質候選物樣品的制備工作。甲醇(Fisher Chemical，色譜純);無水乙醇(分析純，北京化工廠);娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1 含量測定(高效液相色譜法)

2.1.1 色譜條件[6－7]

色譜柱:Agilent XDB C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇 －水(40∶60);流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;進樣量:10μL;檢測波長:306 nm。

2.1.2 溶液制備

精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇化學純度標準物質適量，分別置50mL容量瓶中，用50%乙醇將樣品完全溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成每1mL溶液中分別含虎杖苷166μg，白藜蘆醇145μg的標準儲備液。精密移取 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL 分別置10mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，得虎杖苷質量濃度分別為 1.66，8.29，16.60，33.20，82.90，166.00 μg/mL，白藜蘆醇質量濃度分別為 1.45，7.23，14.50，28.90，72.30，145.00 μg/mL標準溶液。取中藥材虎杖約100mg，精密稱定，精密加入50%乙醇25mL，稱定質量，加熱回流30min，冷卻至室溫，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗:分別吸取虎杖苷、白藜蘆醇標準溶液和供試品溶液按擬訂的色譜條件進樣，色譜圖見圖1。可見，虎杖苷與白藜蘆醇的分離度好，且周圍無其他色譜峰干擾，表明擬訂的色譜條件可行。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密移取6種不同質量濃度的標準溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以標準溶液的質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。虎杖苷色譜峰面積值分別為 69.18，354.3，709.5，1 461，3 592，7 227，回歸方程為 Y=43.604X －4.880 2，r2=1.000 0(n=6);白藜蘆醇色譜峰面積值分別為 108.6，520.0，1 063，2 125，5 351，10 766，回歸方程為 Y=74.533X －17.083，r2=1.000 0(n=6)。結果表明，虎杖苷和白藜蘆醇質量濃度分別在1.7～165.7μg/mL和1.5～144.5μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇的標準貯備液1mL，置10mL容量瓶，50%乙醇稀釋至刻度，按擬訂的色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖;結果虎杖苷峰面積值分別為714.8，715.3，714.4，715.5，715.7，716.0，白藜蘆醇峰面積值分別為1 066，1 072，1 065，1 071，1 066，1 065，RSD 分別為 0.08% 和0.30%(n=6)，表明儀器精密度良好。精密移取虎杖苷與白藜蘆醇的標準儲備液1mL，置10mL容量瓶中，各6份，用50%乙醇稀釋至刻度，按擬訂的色譜條件各重復進樣3次，分別記錄色譜圖;結果虎杖苷峰面積均值分別為 713.1，715.1，713.1，715.2，714.6，712.3，白藜蘆醇峰面積均值分別為 1 068，1 051，1 065，1 062，1 064，1 065，RSD 分別為 0.17% 和 0.54%(n=6)，表明方法精密度良好。

重復性試驗:稱取中藥材虎杖樣品6份，每份100mg，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件進樣測定。結果虎杖苷相對百分含量分別為 1.486% ，1.486% ，1.504% ，1.500% ，1.489% ，1.481%，平均含量為 1.491%，RSD 為 0.60%(n=6);白藜蘆醇相對百分含量分別為 0.298% ，0.294% ，0.292% ，0.292% ，0.294% ，0.290% ，平均含量為 0.293% ，RSD 為 1.03%(n=6)，可見，供試品溶液制備方法重現性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，避光放置，分別于配制后0，4，8，12，16，24 h 時[5－6]依法進樣測定。結果虎杖苷相對百分含量 分 別 為 1.491% ，1.494% ，1.496% ，1.488% ，1.499% ，1.483%，RSD為0.38%(n=6);白藜蘆醇相對百分含量分別為0.300% ，0.304% ，0.298% ，0.307% ，0.301% ，0.306% ，RSD 為1.19%(n=6)。可見供試品溶液在24 h內穩定性良好。

回收率試驗:稱取中藥材虎杖樣品6份，每份100mg，再加入已知含量的標準物質(虎杖苷1.49%，白藜蘆醇0.29%)，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定含量，計算回收率。結果虎杖苷回收率分別為 98.52% ，99.72% ，99.24% ，99.39% ，99.15% ，98.86%，平均 99.15%，RSD 為 0.42%(n=6);白藜蘆醇回收率分別為 99.76%，99.87%，98.96%，99.34%，99.89%，99.72%，平均99.59%，RSD 為 0.37%(n=6)。可見，方法回收率良好。

2.1.4 均勻性試驗

從500支中藥材虎杖標準物質候選物中隨機抽取15瓶樣品，每瓶樣品均按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂的色譜條件測定含量，共獲得45個均勻性檢驗數據，見表1。采用單因素方差分析[7－8]對均勻性檢驗數據進行組內和組間統計分析，測定虎杖苷含量時 F值為1.71，測定白藜蘆醇含量時 F值為1.63，F0.05(14，30)=2.04，即 F ＜ F0.05(14，30)。結果表明，中藥材虎杖成分分析標準物質樣品具有良好的均勻性。

表1 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量均勻性檢驗數據

2.1.5 長期穩定性試驗

將密封包裝后的標準物質候選物樣品放置在常溫條件下長期保存，考察其穩定性，并分別于 0，1，2，4，6，12 月時隨機抽樣，每個點隨機抽樣6瓶，依法測定虎杖苷和白藜蘆醇含量。測定結果見表2。以保存時間(X)，成分含量(Y)分別擬合兩種化學成分的直線，得直線回歸方程，計算斜率的不確定度[8－9]，結果如下。虎杖苷Y=0.000 005X+0.0149，白藜蘆醇 Y= －0.000 000 8X+0.003，

表2 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量長期穩定性數據

二者的自由度均為 n－2=6－2=4和 P=0.95(95%置信區間)的 t因子等于2.776，由于虎杖苷和白藜蘆醇含量測定值|a|＜×S(a)，故斜率是不顯著的，表明中藥材虎杖成分分析標準物質候選物在12個月內的穩定性良好。

2.2 成分含量標準值及不確定度評估

2.2.1 成分含量標準值定值

依據國家一級標準物質技術規范的定值，采用6家實驗室聯合定值方法實現對中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分進行定值。結果見表3。采用格拉布斯檢驗，剔除可疑值，并采用科克倫(Cochran)等精度檢驗，證明虎杖苷含量和白藜蘆醇含量的測量數據均屬等精度數據。計算得6家聯合定值的中藥材虎杖中虎杖苷含量標準值 P1=1.473%，S1=0.000 021 4;白藜蘆醇含量標準值 P2=0.294%，S2=0.000 026 6。

2.2.2 不確定度評定

1)成分含量標準值的不確定度評估

經分析可知，其標準值的總不確定度由5個部分組成:由虎杖苷和白藜蘆醇國家一級標準物質引入的不確定度值;由測量數據的不確定度引入的不確定度，包括了中藥材中有效成分提取及含量測定過程引入的不確定度;由聯合定值的標準曲線擬合引入的不確定度;由樣品不均勻性引入的不確定度;由樣品穩定性引入的不確定度。這5個部分不確定度構成標準值的總不確定度[8－11]。

表3 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量的聯合定值數據

2)不確定度的量化分析

國家一級標準物質引入的不確定度值 urel(p):虎杖苷純度標準物質的量值為(99.6±0.7)%，標準不確定度值為0.7%/2=0.35% ，相 對 標 準 不 確 定 度 值 為 urel(p1)=0.35%/99.6%=0.003 514。白藜蘆醇純度標準物質的量值為(99.4 ±0.5)%，其標準不確定度值為0.5%/2=0.25%，相對標準不確定度值為urel(p2)=0.25%/99.4%=0.002 515。測量數據的不確定度值urel(j)。

聯合定值的標準曲線擬合引入的不確定度值 urel(f):按照國際標準化組織標準物指南35(以下簡稱指南35)規定，標準曲線擬合的標準偏差計算公式為 urel(f)=u(c1)/c1。

S(A)為標準溶液峰面積的標準偏差，m為中藥材虎杖溶液的測定次數，n為標準溶液的總測定次數，C0為標準溶液的質量濃度(μg/mL)，C1為中藥材虎杖溶液的質量濃度(μg/mL)，i為校準溶液的第 n次測量。以檢測樣品的溶液質量濃度為 X、峰面積 Y擬合標準曲線而獲得直線。聯合標定單位的標準曲線相對不確定度 urel(f)值結果見表4，取其中的最大值計算。

表4 聯合定值標準曲線引入的相對不確定度數據

樣品均勻性引入的不確定度 urel(SH):由均勻性產生的不確定度可按照指南35規定，數學模型為

式中 SH表示均勻性產生的不確定度，n表示測定次數，MS組間表示組間均方差，MS組內表示組內均方差。表5給出中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量均勻性產生的不確定度數據，其中虎杖苷為 5.32 ×10－5，白藜蘆醇為 2.32 ×10－5，與測量產生的不確定度相比，均勻性產生的不確定度較小，可以忽略。

表5 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量均勻性產生的不確定度數據

樣品穩定性引入的不確定度 urel(St):

式中 S(α)表示斜率產生的不確定度，S表示直線的標準偏差，Xi表示時間點，表示時間均值，St表示穩定性產生的不確定度，t表示時間。由穩定性產生的不確定度值，虎杖苷 urel(St1)=12 × Sα1=1.64×10－4;白藜蘆醇 urel(St2)=12 ×Sα2=1.68 × 10－5。3)合成標準不確定度計算

式中，uc(x)表示前3部分合成標準不確定度，urel(p)表示國家一級標準物質引入的不確定度值，urel(j)表示測量數據引入的不確定度值，urel(f)表示聯合定值的標準曲線擬合引入的不確定度值。計算合成標準不確定度，虎杖苷 uc(x1)=0.006 76%，白藜蘆醇 uc(x2)=0.003 79%。

4)總合成標準不確定度

式中，uc(總)表示總合成標準不確定度，uc(x)表示前3部分合成標準不確定度，urel(SH)表示樣品均勻性引入的不確定度，urel(St)表示樣品穩定性引入的不確定度。計算總合成標準不確定度，虎杖苷 uc(總1)=0.0001855，白藜蘆醇 uc(總2)=0.000047 5。

5)擴展不確定度

數學模型:U=k×uc(總)。式中，U表示擴展不確定度，k表示包含因子，uc(總)表示總合成標準不確定度。k取2，P=95%，計算擴展不確定度，虎杖苷 U1=0.037 1%，白藜蘆醇 U2=0.009 5%。

6)成分含量標準值及不確定度表示

在測量不確定度的最終計算中，一般采用只進不舍的規則。故中藥材虎杖中，虎杖苷含量標準值及不確定度值為(1.47±0.04)%，k=2，P=0.95;白藜蘆醇含量標準值及不確定度值為(0.29 ±0.01)%，k=2，P=0.95。

3 討論

本研究成功地賦予復雜體系中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量的標準值及不確定度值，為國際公認的有證計量標準物質研制，提供了有效的檢測技術、全面的計算數學模型、標準值和不確定度的評估方法，對我國標準物質研制具有較好的技術示范作用。

中藥材有證國家級標準物質研究在我國剛剛起步，本研究將為我國中藥材乃至中成藥的質量標準提高、與國際公認的計量標準技術接軌、推動中藥的標準化和現代化，提供了標準物質、物質標準、標準技術方法。

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