三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液的質量控制及安全性研究＊

陳琴華，李 鵬，朱 軍

(湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部·藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008)

三磷酸腺苷(ATP)是一種具有多種重要生理活性的輔酶，參與蛋白質、脂肪、糖、磷脂及核酸的合成與代謝，適用于因細胞損傷后細胞酶功能減退引起的疾病，臨床上主要用于心律失常、心力衰竭、心肌炎的治療[1]，以及腦出血后遺癥和肝炎疾病的輔助治療[2－3]。目前市場上供注射用的ATP劑型為水針和粉針，海南新隆藥業有限公司聯合江西科倫藥業有限公司解決了ATP不穩定的工藝難題[4]，首次研究申報了大容量氯化鈉注射液，減少了藥物配液交叉污染的機會，提高了該藥的臨床應用水平。現對ATP氯化鈉注射液的質量可控性和制劑安全性進行了探討，報道如下。

1 試驗材料

高效液相色譜儀，包括SPD－10A檢測器、LC－10AT泵(日本島津公司);pHs－25型酸度計。ATP對照品(含量大于99.5%);ATP氯化鈉注射液(規格為 100 mL∶20 mg，批號為050601，050602，050603，江西科倫藥業有限公司);甲醇(色譜純)，其他試劑(分析純)。豚鼠，雄性，體重250～350 g;家兔，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg;均由中國醫科大學第二臨床學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK遼2003－2009。

2 方法與結果

2.1 質量控制

2.1.1 總核苷酸測定

精密量取本品5mL，置50mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉35.8 g，加水至1 000mL，無水磷酸二氫鉀13.6 g，加水至 1 000mL，調節 pH 至 7.0)至刻度，振搖使混勻。以上述緩沖液為空白溶液，照分光光度法測定，在259 nm波長處測定吸光度，按ATP的百分吸收系數為279，計算總核苷酸含量。

2.1.2 ATP 的重量比

色譜柱為 Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，流動相為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉35.8 g，磷酸二氫鉀13.6 g，加水900mL溶解，用氫氧化鈉溶液調節pH為7.0，加入四丁基溴化銨 1.61 g，加水至 1000mL)－甲醇(95∶5)，柱溫35℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為259 nm。在此色譜條件下理論板數按ATP峰計算應大于2 000，各色譜峰的分離度應大于1.5。按出峰次序依次記錄一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的峰面積，高效液相色譜分析見圖1。參照2010年版《中國藥典(二部)》[5]方法計算ATP的重量比。ATP含量(%)=[總核苷酸×ATP的重量比(%)]/標示量，有關物質(%)=1－ATP的重量比(%)。

2.1.3 標準曲線制備

紫外分光光度法:精密稱取ATP對照品20 mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分別置10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，照分光光度法測定。結果表明，ATP質量濃度在12～28μg/mL范圍內與吸光度具有良好的線性關系，回歸方程為Y=0.032 2X －0.033 5，r=0.999 4(n=5)。

圖1 ATP氯化鈉注射液高效液相色譜圖

高效液相色譜法:精密稱取ATP對照品20mg，置10mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取 0.2，0.6，1.0，1.4，1.8mL，分別置10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。分別吸取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，ATP質量濃度在0.04～0.36 g/L范圍內與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程為 Y=2×107X+2×104，r=0.999 6(n=5)。

2.1.4 回收率試驗

精密稱取16，20，24mg的ATP對照品各3份，分別加入處方量輔料，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，依法測定。結果總核苷酸和ATP的重量比回收率(n=3)分別為 99.1%，100.8% 和 99.3% 。

2.1.5 精密度和穩定性試驗

取同一份ATP氯化鈉注射液，依法測定6次，測定總核苷酸和ATP重量比。結果含量和 RSD分別為102.8%和0.85%。于0，2，4，6，8，12 h 時依法測定同一份樣品，結果表明樣品在 12 h內穩定。

2.1.6 重復性試驗

取ATP氯化鈉注射液6份，依法測定總核苷酸和ATP重量比。結果含量和 RSD分別為102.8%和1.15%。

2.1.7 含量測定和有關物質

取本品3批樣品，測定總核苷酸和ATP重量比，計算有關物質和標示含量。結果見表1。

表1 樣品有關物質和含量測定結果(n=3)

2.2 安全性試驗

2.2.1 過敏性試驗

取健康豚鼠18只，體重250～350 g，隨機平均分成3組，分別為生理鹽水組、陽性對照組(10%雞蛋清，生理鹽水與雞蛋清9∶1混合即成)和ATP氯化鈉注射液組，各組每只動物隔日腹腔注射受試藥物0.5mL，共3次。首次注射后的第14天和第21天，各組分別取3只豚鼠，每只分別給予對應的受試藥物1.0mL進行攻擊，觀察過敏反應現象。陽性對照組豚鼠在注射后共有5只出現呼吸困難、噴嚏、干嘔、咳嗽等過敏反應，給藥組及陰性對照組兩次攻擊后均未見異常表現，結果均為陰性。

2.2.2 體外溶血試驗

取兔血，離心、洗滌后，制備體積分數為2%的紅細胞混懸液。取試管7支，分別加入2.5 mL紅細胞混懸液，其中兩支分別加入2.5mL蒸餾水和生理鹽水，作為陽性對照和陰性對照，其他5 只試管中依次加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL 的 ATP 氯化鈉注射液，各試管分別補加生理鹽水至5 mL，搖勻，置37℃水浴保溫，連續觀察4 h。陽性對照管加入蒸餾水后，立即出現溶血現象;各供試藥液管及陰性對照管未發生溶血現象，紅細胞逐漸沉于管底，經振搖后可均勻散開，說明亦無紅細胞凝聚現象。

2.2.3 血管刺激性試驗

取家兔8只，分2組，每組4只，分別于耳緣靜脈滴注ATP氯化鈉注射液和0.9%氯化鈉注射液，滴注量均為4mL/kg，滴速為1.0mL/min，每天1次，連續3 d，給藥期間每日觀察血管注射部位及整個外耳廓有無變化。于第3次給藥后24 h將動物處死，取給藥處血管及周邊組織，以5%甲醛溶液固定、切片、染色，切片部位為進針部位向心端1 cm及2 cm處。給藥組、0.9%氯化鈉注射液對照組血管均未見異常病理改變，耳緣靜脈內無血栓形成，血管內皮細胞及周圍組織未見水腫、炎性浸潤或壞死等異常改變。

3 討論

含量和有關物質是衡量藥物有效性和內在品質最重要的指標，一般來說，越接近標示含量，有關物質越少，則藥物的品質越高。ATP化學結構不穩定，高溫和長期存放時容易分解成二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)，這兩種物質不具有毒副作用，體內與ATP存在相互轉化關系。但是，藥品注冊管理辦法規定有關物質作為藥品質量控制的指標，必須規定限度。中國藥典標準和部頒生化藥品標準對ATP原料和制劑有關物質未作要求，僅要求原料含量分別為大于95%和85%。曾依法測定了多個廠家上市的ATP水針制劑，有關物質均在10%左右。ATP氯化鈉注射液采用精制高純度原料，含量高，制劑有關物質低，確保了臨床應用的有效性。

文中建立的質量控制方法，能控制ATP氯化鈉注射液的質量。按照2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅠB注射劑項下有關要求，質量標準還增加鑒別、細菌內毒素和氯化鈉含量測定等項目，以確保藥品的安全有效。特殊安全性試驗表明，ATP氯化鈉注射液對受試豚鼠無致敏作用，對家兔紅細胞無明顯體外溶血和凝集作用，對家兔耳緣靜脈亦無明顯刺激性，符合臨床安全性方面的要求。由此可見，ATP氯化鈉注射液安全、有效、質量可控。

[1]運 鋒，董寧程，向東韓，等.三磷酸腺苷治療陣發性室上性心動過速的臨床研究[J].臨床急診雜志，2004，5(3):4－6.

[2]易生禹，只達石.顱腦損傷診治[M].北京:人民衛生出版社，2000:110－112.

[3]王 凱，汪素文.臨床肝病治療學[M].濟南:山東大學出版社，2002:80－90.

[4]劉小清.三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液及其制備方法.中國，03142254.3[P].2004 － 03 － 31.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:28－29.