瓜蔞－薤白藥對用于抗大鼠急性心肌缺血時對MAPK信號通路的影響＊

雷 燕，黃 芳，韓林濤，但漢雄，嚴標文，李明明

(1.湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065;2.湖北中醫藥大學中藥教研室，湖北 武漢 430065;3.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065)

現代藥理研究表明，瓜蔞－薤白藥對對心肌缺血及心肌缺血缺血－再灌注損傷有較好的療效，其改善作用可能與擴管、減輕鈣超載、抗氧化、保護血管內皮等有關[1－7]。近年來隨著對心肌缺血保護機制的深入研究，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路與心肌缺血的相關性備受關注。最新研究表明，MAPK通路可能是預處理和后處理保護心肌、抑制損傷的細胞內信號通路機制的共同靶點。因此，從MAPK信號通路闡明藥物的保護機制出發，極有希望尋找到理想的治療策略以減輕心肌缺血的損傷[8－11]。筆者在前期基礎上，用SD大鼠建立心肌缺血模型，從MAPK信號轉導途徑深入探討瓜蔞薤白改善急性心肌缺血的作用機制，以期闡釋瓜蔞－薤白藥對治療胸痹的物質基礎及作用機理，從而為最終闡明方劑配伍規律與內涵提供科學依據。現報道如下。

1 材料和方法

1.1 藥物、動物及儀器、試劑

藥物:瓜蔞實、薤白藥材購自于武漢劉有余藥業有限責任公司。瓜蔞－薤白藥對和單味藥均由湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室自制。瓜蔞煎液，取瓜蔞皮250 g、瓜蔞籽250 g與12%乙醇600mL共煎，減壓濃縮至400mL。薤白煎液，薤白250 g與12%乙醇600mL共煎，減壓濃縮至400mL。瓜蔞－薤白煎液，取瓜蔞實和薤白(500 g∶250 g)與白酒7 L(低濃度米釀酒，1 400mL)共煎，減壓濃縮至2 L(400mL))。為確保試驗結果的可比性，同一樣品的所有試驗都用同一批藥材。含生藥量瓜蔞－薤白煎液為1.875 g/mL，瓜蔞煎液為1.25 g/mL，薤白煎液為 0.625 g/mL。

動物:健康SD雄性大鼠，體重150～200 g，清潔級，由華中科技大學同濟醫學院提供，合格證號為SCXK(鄂)2010－0007。

試劑:SDS－PAGE凝膠制備試劑盒，目錄號為G2003，PMSF(100mmol/L)，目錄號為G2008，均購于谷歌生物。超敏ECL化學發光試劑盒BeyoECLPlus，目錄號為P0018，購于碧云天生物技術研究所(Beyotime Institute of Biotechnology)。Tween－20，目錄號為 0777，Amresco公司;蛋白 Marker(10－170 kDa)，目錄號為sm0671，Fermentas公司;Actin，貨號為 SC －1616R，SANTA 公司。一抗:BS4322 p－JNK1/2/3(T183/Y185)，BS5016 p－ERK1/2(T202/Y204)，BS4766 p－p38(Y182)，均購于 Bioworld公司。二抗:HRP標記兔抗山羊，目錄號為14－13－06;HRP標記山羊抗兔，目錄號為074－1506;HRP標記兔抗小鼠，目錄號為074－1806;HRP標記兔抗大鼠，目錄號為14－16－06;均購于KPL公司。2.5% 戊二醛:賽莫飛世爾生物化學制品有限公司，批號為NUH0180，201011563。

儀器:BL－420S型生物機能試驗系統，HX－100E型小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);DYY－6C型電泳儀(北京市六一儀器廠);752－P型紫外可見光分光光度計(上海現科儀器有限公司);Neofuge 15R型冷凍離心機(Heal Force公司);WD－9405A型脫色搖床(北京六一儀器廠);HITACHI7080型全自動生化分析儀(日本HITACHI公司);LKB－V型超薄切片機(瑞典BROMMA公司);日立H－600型透射電鏡(日本日立公司);冷凍離心機;－80℃低溫冰箱。

1.2 試驗方法

動物分組及處理:50只SD大鼠隨機分為5組，假手術(SHAM)組、瓜蔞薤白(TKAM)組(18.75 g/kg)、瓜蔞(TK)組(12.5 g/kg)、薤白(AM)組(6.25 g/kg)、模型(I/R)組，每組 10只。假手術組和模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液，每日灌胃1次，灌胃容量為10.0mL/kg，連續灌胃14 d。各組大鼠用10% 水合氯醛麻醉，固定，采用標準肢體Ⅱ導聯連續心電監測。行氣管插管，連接小動物呼吸機。經左冠狀動脈左前降支下淺層心肌穿一5/0號絲線，假手術組僅穿線不結扎，其余各組均立即打活結結扎冠狀動脈左前降支(LAD)，以同步心電圖ST段抬高及心臟局部紫紺為結扎成功標志，形成急性心肌缺血，缺血30min。

組織標本采集與檢測:取試驗后的大鼠心肌組織，固定于2.5%戊二醛，0.1mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，再用鋨酸(O3O41%)固定，0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，酒精梯度脫水(50%，70%，80%，95%，100%2 次)、每次 15min。純丙酮脫水 2 次(15min)，EPON812:丙酮(1 ∶1)浸透 30min，純包埋液浸透 1 h，純包埋液固化37℃ 24 h后60℃ 48 h。用LKB－V型超薄切片機(瑞典BROMMA公司)切片，行鈾、鉛染色(醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛)。用H－600型透射電鏡(日本日立公司)觀察(×15 000倍)。

Western Blot法測定MAPKs表達:心肌缺血研究試驗結束后，取各組心肌組織，提取左心室組織蛋白;取蛋白樣品用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;上樣，電泳;采用濕式轉膜方式檢測ERK1/2，p38MAPK，C－Jun蛋白表達，一抗為兔抗人單克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG;ECL自顯影技術觀察蛋白的表達，從MAPKs信號通路研究藥對瓜蔞－薤白藥對改善急性心肌缺血心肌損傷的保護作用及機制。

2 結果

2.1 對大鼠急性缺血心肌組織學的影響

假手術組為正常心肌細胞，潤盤清晰可見，肌纖維組織排列整齊;模型組線粒體極度腫脹，灶空化，嵴排列凌亂或崩解，肌纖維扭曲;瓜蔞組較模型組稍有改善，肌纖維排列扭曲，可見部分灶空化和嵴排列紊亂;薤白組肌纖維結構無明顯扭曲，細胞間質有水腫;瓜蔞薤白組線粒體有輕度腫脹，肌纖維排列整齊。詳見圖1。

圖1 電鏡下大鼠急性心肌缺血心肌組織切片(75 KV×15 000)

2.2 對大鼠急性缺血MAPKs的表達

由AlphaEase FC凝膠圖像分析軟件取灰度值，結果見表1。可見，與瓜蔞、薤白、瓜蔞薤白組相比，假手術組心肌P－p38表達極少。瓜蔞薤白、薤白、瓜蔞組兩兩比較，P－p38表達依次降低，假手術組P－p38表達較少。有研究顯示[12]，把模型組的心肌暴露于高含氧量的環境，心肌功能障礙和梗死面積可大大減輕，而p38MAPK卻大量磷酸化，進一步提示了瓜蔞－薤白煎液可抑制被激活的p38信號通路，減少由其引起的心肌損傷，對心臟起到保護作用。此外，由表1也可看出，給藥組與模型組中，P－JNK的表達在瓜蔞薤白組中最少，說明瓜蔞－薤白藥對抑制了JNK通路的表達，同樣也降低了由于急性心肌梗死引起的心肌損傷，從而起到了保護心臟的作用。各個給藥組依次比較，可以看出，在瓜蔞薤白藥對的誘導作用下，各給藥組P－ERK的表達均依次增加。

表1 瓜蔞薤白對大鼠心肌急性缺血MAPKs通路的表達結果

3 討論

近年來，對瓜蔞－薤白藥對中瓜蔞、薤白單味藥的藥理研究較多。為了深化瓜蔞－薤白藥對的藥理學研究，更好地利用瓜蔞、薤白資源，本試驗驗探討了瓜蔞－薤白藥對單用與配伍后大鼠抗急性心肌缺血心肌損傷中心肌組織學的影響和MAPKs信號通路在其中的作用。且本次試驗在已有文獻研究的基礎上[13－14]，選取了相對居中的瓜蔞－薤白煎液的有效質量濃度(1.875 g/mL)，進一步證明了以下結論:瓜蔞薤白配伍后抗心肌組織損傷的效果更顯著;3種絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路參與了瓜蔞薤白抗大鼠急性心肌缺血所致心肌損傷作用的分子機制，并起到了不同的作用，且瓜蔞－薤白藥對配伍后的結果更明顯。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是一組絲氨酸－蘇氨酸激酶系，受各種刺激激活，如生長因子和細胞應激等。哺乳動物細胞內證實3種主要的MAPKs信號途徑包括細胞外信號相關蛋白激酶(ERK1/2)，p38MAPK和c－Jun氨基端蛋白激酶(JNKs)/應激活化蛋白激酶(SAPKs)。活化的MAPKs轉位入核后引起轉錄因子磷酸化，提高應激蛋白基因轉錄水平，合成相關蛋白質，從而發揮心肌保護作用。

已有研究證實，MAPKs信號轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并在引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用。目前，已發現存在著多條并行的MAPKs信號通路，不同的細胞外刺激可使用不同的MAPKs信號通路，通過其相互調控而介導不同的細胞生物學反應[15]。其中，細胞外信號調節蛋白激酶ERK(extracellular signal－relat－ed kinase)是重要的信號轉導途徑之一，可調節細胞的多種生理功能，是傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白。它正常定位于胞漿，有絲分裂原刺激后部分類型的ERK能向細胞核轉位，并具有調控轉錄活性的能力，調節轉錄因子活性，產生細胞效應。JNK是一種應激激活的蛋白激酶，由于JNK信號轉導途徑在細胞應激反應中起重要作用，并被多種細胞外應激信號激活，因而JNK也被稱為應激活化蛋白激酶(SAPK)。SAPK信號轉導途徑極其復雜，并與ERK及p38MAPK等信號轉導途徑有密切關系。

p38絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路在炎癥、應激、凋亡、細胞周期和生長的多種生理和病理過程中發揮著重要作用。p38在細胞核內和胞質都有表達。在應激條件下，胞質內的p38可以轉移到核內，通過磷酸化激活各種轉錄因子調控相關基因的表達。有報道稱[16]，缺血使p38磷酸化的程度很小，但本試驗可以證明，在瓜蔞－薤白藥對的作用下，p38的磷酸化會顯著增高，提示給藥后的心肌缺血可使大量細胞因子激活，進一步推論出p38的磷酸化與心肌缺血引起的心肌損傷產生的過氧化物激活有關[17]。

心肌缺血及缺血－再灌注損傷在中醫學中屬于“胸痹”“心痛”等范疇。栝蔞薤白半夏湯出自《金匱要略·胸痹》篇，是臨床治療胸痹的有效方。該方可通過調節血管內皮細胞產生的一氧化氮和內皮素平衡有效防治急性心肌缺血損傷[18－19]。本試驗通過建造心肌缺血－再灌注模型，觀察MAPKs信號轉導通路的表達來研究瓜蔞薤白藥對對急性缺血損傷心肌的影響及可能性機制。本研究結果顯示，與I/R組對照其他各組中，TKAM組P－p38、P－JNK的表達與SHAM組最為接近，而P－ERK的表達在TKAM組中最多。由此推論，瓜蔞薤白煎液能有效抑制大鼠急性心肌缺血心肌損傷，其機制之一可能與MAPKs的3條信號通路的活化相關。

MAPKs 3種信號途徑均可在心肌缺血－再灌注損傷過程中激活。如缺血前激活心肌細胞中ERK信號通路，對于介導心臟內源性保護配體有著一定的作用[20]。p38MAPKs和JNK/SAKPs是急性心肌缺血后心肌凋亡信號轉導的關鍵因子，在決定心肌缺血損傷程度方面扮演了重要角色[21－22]。

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