頂空氣相色譜法快速測(cè)定全血中乙醇與甲醇的含量

趙東玲，王粉安，鄭海波，馬麗霞

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)院，陜西 西安 710061;2.瑞鑫藥業(yè)有限公司，陜西 西安 710061;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，陜西 西安 710061)

在打擊假酒和非法勾兌酒案件、酒后駕車事故責(zé)任鑒定及臨床上甲醇和乙醇中毒的診斷治療等方面，都需要測(cè)定相關(guān)事件當(dāng)事人血液甲醇與乙醇的質(zhì)量濃度作為判斷指標(biāo)和證據(jù)。甲醇與乙醇的檢測(cè)方法有多種[1－5]，如化學(xué)法、醇脫氫酶法、氣相色譜法等，但關(guān)于全血中甲醇與乙醇同步檢測(cè)的報(bào)道很少。筆者建立了檢測(cè)全血中甲醇與乙醇的快速頂空氣相色譜法(HS－GC)，以外標(biāo)法定量，結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)便。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津GC－2014C型氣相色譜系統(tǒng)及其工作站;DK－3001A型頂空進(jìn)樣器(北京中興分析儀器新技術(shù)研究所);TB－215D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。乙醇、甲醇均為色譜純?cè)噭?分析用水均為雙蒸水，本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:AT－PEG－20M 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:200℃;柱溫:40℃;載氣:高純氮?dú)?檢測(cè)器:FID;溫度:250℃;分流比:20∶1;檢測(cè)時(shí)間6 min;加熱箱溫度70℃;傳輸線溫度110℃;樣品瓶加熱平衡時(shí)間10.0 min;取樣針溫度105 ℃;進(jìn)樣時(shí)間 1.0 min;樣品瓶體積 10.0 mL。

2.2 溶液制備

用精密移液器取含有甲醇和乙醇的樣品血0.50 mL加入樣品瓶?jī)?nèi)，蓋上硅橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻。準(zhǔn)確稱取10.004 g甲醇標(biāo)準(zhǔn)品和10.007 g無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(含量不小于99.9%)，分別置于100 mL容量瓶中，添加雙蒸水至刻度，混勻，得100 g/L甲醇和乙醇貯備液，并將貯備液稀釋得到質(zhì)量濃度為 50，25，10，5，2.5 g/L 的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液。密封，冷藏保存。

2.3 檢測(cè)條件選擇

色譜條件:參考有關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室儀器條件，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度如2.1項(xiàng)，色譜柱溫度依次設(shè)定為60，50，40℃，考察甲醇與乙醇的分離效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在較高柱溫(50℃和60℃)時(shí)甲醇與乙醇的分離度差，60℃時(shí)兩物質(zhì)的色譜峰甚至部分重疊。但當(dāng)柱溫為40℃時(shí)甲醇和乙醇可達(dá)基線分離，峰形良好，出峰穩(wěn)定(見圖1)。兩 物 質(zhì) 的 保 留 時(shí) 間 分 別 為 甲 醇(3.69±0.01)min，乙 醇(4.50±0.03)min。在此條件下，未見血液中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 氣相色譜圖

樣品平衡溫度:取0.475 mL空白血樣，分別添加50 g/L的甲醇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用液15 μL和50 g/L的乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液10 μL，得到甲醇質(zhì)量濃度為1.5 g/L、乙醇質(zhì)量濃度為1.0 g/L的空白添加血樣，考察45～75℃之間血液樣品平衡溫度對(duì)檢測(cè)的影響。平衡時(shí)間均為10 min。在各個(gè)設(shè)定溫度條件下分別檢測(cè)3個(gè)平行樣品，記錄峰面積并計(jì)算 RSD。結(jié)果見表1。可見，甲醇和乙醇的峰面積隨溫度的升高而增加，在70℃和75℃時(shí)，甲醇和乙醇的峰面積變化最小，且在70℃兩種物質(zhì)的 RSD最小，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，故選擇70℃作為樣品平衡溫度。

表1 平衡溫度與血液中甲醇和乙醇峰面積的關(guān)系(n=3)

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取0.48 mL空白血樣，分別添加10 μL質(zhì)量濃度為 2.5，5，10，25，50，100 g/L 的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，得到質(zhì)量濃度為 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 g/L 甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)，以血液中甲醇和乙醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、甲醇和乙醇的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，甲醇 Y=12 147 X －27.654，r=0.999 7;乙醇 Y=13 317 X －75.328，r=0.999 9。甲醇與乙醇的最低檢出限為 0.01 g/L。

精密度與回收試驗(yàn):取甲醇與乙醇配制質(zhì)量濃度均為0.1，1.0，2.0 g/L的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的空白添加血樣，每個(gè)質(zhì)量濃度各取份，以所建方法在3 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，記錄甲醇與乙醇峰面積，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。同時(shí)計(jì)算測(cè)得量，按照測(cè)得量和添加量之比計(jì)算回收率(見表2)。結(jié)果表明，該方法具有較好的回收率。

表2 甲醇和乙醇的回收率和精密度(n=6，%)

干擾試驗(yàn):在空白血樣中加入乙醛、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯，在此條件下進(jìn)行檢測(cè)，這些物質(zhì)峰形良好，分離度不低于1.5，對(duì)甲醇和乙醇的檢測(cè)無(wú)干擾。

2.5 樣品含量檢測(cè)

取一送檢的飲用可疑假酒者的血液，用上述所建立的方法檢測(cè)，結(jié)果檢出甲醇含量為0.12 g/L，乙醇含量1.36 g/L。

3 討論

在血液乙醇的頂空氣相色譜檢測(cè)中，常用叔丁醇作為內(nèi)標(biāo)。但當(dāng)有甲醇存在時(shí)，在建立頂空和氣相色譜分析條件過(guò)程中發(fā)現(xiàn)叔丁醇與甲醇的出峰時(shí)間相近，互相干擾，兩者無(wú)法區(qū)分。因此，本研究未采用內(nèi)標(biāo)法，而用外標(biāo)法檢測(cè)血液中的甲醇和乙醇。但在干擾試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙醛、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯對(duì)甲醇和乙醇的檢測(cè)均無(wú)干擾，而乙醛、正丙醇、正丁醇、乙酸乙酯常被作為酒類檢測(cè)中的目標(biāo)物，故在以后的研究中可考慮用異丙醇作為內(nèi)標(biāo)。所建立的方法同步檢測(cè)全血中的甲醇和乙醇，樣品處理簡(jiǎn)單，兩者分離良好，回收率高，重復(fù)性好，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，分析時(shí)間短，為實(shí)際應(yīng)用提供了快速的檢測(cè)方法和依據(jù)。

[1]GB/T5009.48－2003，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(食品理化檢驗(yàn)部分)[S].

[2]謝廣明，潘叫全，劉澤春.人體組織和血液中殘留甲醇檢測(cè)方法探討[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，21(3):83.

[3]林 佶，段毅宏，余曉萍.人體血液中甲醇的GC/MS定性定量分析[J].職業(yè)與健康，2005(2):213－214.

[4]李勇勤，謝秀紅，許廣榮，等.毛細(xì)管色譜柱頂空氣相色譜法測(cè)定血中甲醇的含量[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008(18):3 589－3 590.

[5]代 娟，陳 曼，賴 翼，等.直接進(jìn)樣毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定血液中乙醇含量的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010(2):283－284.