磷丙泊酚鈉注射液細菌內毒素檢查的方法學研究

魏 萍，李鋒武，衛星華，高 琳

(陜西省西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054)

磷丙泊酚鈉商品名為 Lusedra，由美國 Eisai公司研發，于2008年12月12日由美國與食品藥物管理局(FDA)批準上市，臨床用作成年患者診斷或治療操作過程的鎮靜催眠劑。磷丙泊酚鈉是丙泊酚的一種水溶性的前體藥物，該前藥靜脈注射給藥后在體內被內皮細胞表面的堿性磷酸酶代謝，產生活性藥物丙泊酚，其可在大腦組織內迅速達到平衡，從而發揮劑量依賴性鎮靜催眠作用[1]。為了進一步控制該藥品的質量，根據2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE的規定[2]，建立了磷丙泊酚鈉注射液細菌內毒素檢查方法。

1 儀器與試藥

漩渦混合器(天津天大天發設備有限公司);細菌內毒素凝膠檢測儀(天津天大天發設備有限公司)。鱟試劑(TAL，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號為111010，標示靈敏度0.25 EU/mL;批號為110605，標示靈敏度0.06 EU/mL。湛江博康海洋生物有限公司，批號為 1203080，標示靈敏度 0.25 EU/mL，批號為1102173，標示靈敏度0.06 EU/mL)。細菌內毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號為150601－201174，規格為160 EU/支);磷丙泊酚鈉注射液(陜西合成藥業有限公司，批號分別為 110601，110602，110603，規格 35 mg/mL);細菌內毒素檢查用水(BET用水，中國食品藥品檢定研究院，批號為201001);Tris·HCl緩沖液(pH 7.0，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號為100910)。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值確定

按細菌內毒素檢查限值公式 L=K/M，其中 K為按規定的給藥途徑下人用每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5.0 EU/(kg·h)，M為人用每1 h每1 kg體重的最大劑量。根據生產廠家提供的標準給藥方案，磷丙泊酚鈉注射液的給藥方案由首次給藥和追加給藥兩部分組成，根據患者的體重先給予首次劑量，然后根據給藥后的癥狀逐次追加給藥，追加給藥的頻率不超過每4 min 1次。據此，估算1 h后可能給予的最大劑量。則 L=5.0 EU/(kg·h)÷(15+4×15)mL/80(kg·h)=5.33 EU/mL，考慮聯合用藥內毒素相加的安全性，可給予3倍的安全系數，即 L=1.78 EU/mL。

2.2 供試品pH測定

根據2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE規定，供試品溶液的pH在6.0～8.0范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液(或其稀釋液)的pH，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調節。測定3批樣品的 pH，分別為9.09，9.15，9.14。用 Tris·HCl緩沖液(pH=7.0)稀釋批號 110601 供試品至 2.5，5，10，20 倍，測定其 pH 分別為 7.75，7.56，7.42，7.32。4 個稀釋倍數的 pH 均在 6.0～8.0 的范圍內，符合藥典要求。

2.3 鱟試劑靈敏度復核

用 BET 用水將細菌內毒素工作標準品稀釋成 2.0 λ，1.0 λ，0.50 λ和0.25 λ4個濃度的內毒素標準溶液，每一濃度平行制備4支，同時用BET用水做2支陰性對照管，按細菌內毒素檢查法結果判定。見表1。

表1 靈敏度復核結果

2.4 最大有效稀釋倍數確定

根據最大有效稀釋倍數 MVD=CL/λ，對于靈敏度為0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL 的鱟試劑，供試品最大有效稀釋倍數分別為 3.5，7，14，29，58 倍。

2.5 供試品干擾試驗預試驗

取供試品(批號為110601)，分別加Tris·HCl緩沖液(pH=7.0)制成稀釋 2.5，5，10，20 倍的溶液，再分別加內毒素標準品制成含細菌內毒素0.5 EU/mL的溶液，用批號為111010及批號為1203080鱟試劑(λ=0.25 EU/mL)以初步確定供試品的最小不干擾稀釋倍數，結果見表2。可見，磷丙泊酚鈉注射液在稀釋10倍及10倍以上稀釋倍數時，對鱟試劑的凝集反應無增強或抑制作用。

表2 干擾預試驗結果

2.6 供試品干擾試驗

用BET用水和10倍稀釋供試品(用Tris·HCl緩沖液稀釋制成)分別將內毒素標準品制成 2.0 λ，λ，0.5 λ，0.25 λ 的一系列濃度，分別用2個廠家的鱟試劑同時考察3批供試品每個濃度下的干擾情況，每一濃度做4管，同時作陰性對照和陽性對照(細菌內毒素 2.0λ)，結果見表 3。Es在 0.5λ～2λ之內，Et均在 0.5 Es～2 Es之內;磷丙泊酚鈉注射液10倍稀釋液對標示靈敏度為0.25 EU/mL的兩批不同廠家鱟試劑的凝集反應無干擾作用。

表3 干擾試驗結果

2.7 樣品檢測

取供試品，分別用標示靈敏度為0.06 EU/mL的2個廠家的鱟試劑考察其內毒素限值，供試品溶液10倍稀釋。結果見表4。

3 討論

本試驗用兩個廠家的鱟試劑對磷丙泊酚鈉注射液連續3個批號進行了干擾試驗，結果表明，磷丙泊酚鈉注射液在上述試驗中無干擾作用。其內毒素限值為每1 mL磷丙泊酚鈉注射液含內毒素量小于1.78 EU。

表4 磷丙泊酚鈉注射液細菌內毒素檢查結果

對陜西合成藥業有限公司提供的3批磷丙泊酚鈉注射液，用兩個廠家的鱟試劑進行了細菌內毒素檢查，陰性對照管呈陰性，供試品陽性管和陽性對照管均呈陽性，試驗成立，3批供試品的細菌內毒素檢查結果符合規定。

綜上所述，認為磷丙泊酚鈉注射液用細菌內毒素檢查法按每1 mL含細菌內毒素量應小于1.78 EU的限值進行細菌內毒素檢測是可行的。

[1]Revll P，Serradell J，Bolos J.Anesthetic drug[J].Drugs Future，2006，31(10):859－863.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄99－附錄102.