高效液相色譜法測定三維樟柳堿膜中氫溴酸樟柳堿含量

蘭玉坤，梁 靜

(重慶市食品藥品檢驗所，重慶 400121)

氫溴酸樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪根中提取的生物堿的氫溴酸鹽，作為抗膽堿藥，能解除血管痙攣，改善病損區的微循環及局部營養代謝，使病損區黏膜達到正常角化，促進炎癥恢復，有消除口腔斑紋的功能[1]。三維樟柳堿膜為口腔科用藥，方中含有維生素A、維生素E和氫溴酸樟柳堿，在現行檢驗標準中只進行了定性檢驗，沒有定量檢驗方法。三維氫溴酸樟柳堿膜中氫溴酸樟柳堿的含量較少，而且輔料對樟柳堿的吸附作用較大。為有效控制氫溴酸樟柳堿的含量，首先要使樣品中的樟柳堿完全溶出，在此基礎上建立了測定氫溴酸樟柳堿含量的高效液相色譜法。氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿以及硫酸阿托品均為托烷類生物堿，化學結構十分相近，因此將此3種組分作為考察對象，并對色譜條件進行優化考察。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀;二極管陣列檢測器。氫溴酸樟柳堿(批號為 100399－200601)、氫溴酸東莨菪堿(批號為10049－200308)以及硫酸阿托品(批號為100040－200510)對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供;三維樟柳堿膜(批號分別為110301，110302，110303，成都第一制藥有限公司);所用試劑均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Waters C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(pH=3.5)－ 乙腈(93 ∶7);流速:1.0 mL/min;檢測波長:210 nm;進樣體積:100 μL;柱溫:30 ℃ 。在此條件下，理論板數按氫溴酸樟柳堿峰計算不低于3 000，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取氫溴酸樟柳堿對照品、氫溴酸東莨菪堿對照品和硫酸阿托品對照品各適量，加水溶解并稀釋成約20 μg/mL的溶液作為系統適用性試驗溶液。精密稱取氫溴酸樟柳堿對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加水適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含氫溴酸樟柳堿2 μg的對照品溶液。取樣品10片，剪碎，精密稱取2片量(約含氫溴酸樟柳堿20 μg)，置10 mL容量瓶中，加水少量，充分振搖使膜完全潤濕并溶解，再加水稀釋至刻度，搖勻，用濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密稱取氫溴酸樟柳堿對照品0.015 98 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密吸取上述溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)為縱坐標、對照品溶液質量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為 A=101.21 C+2.834 1，r=1.000(n=6)。結果表明，氫溴酸樟柳堿的質量濃度在0.799～7.990 μg/mL范圍內與峰面積線性良好。

精密度試驗:取線性范圍項下質量濃度為1.598μg/mL的樟柳堿對照品溶液100 μL，按上述色譜條件連續進樣6針。結果峰面積的 RSD=0.64%(n=6)，表明方法的精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在 0，1，2，3，4，6，8 h時進樣。結果峰面積的 RSD=2.26%(n=7)，表明供試品溶液在8 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為110301)6份，依法測定。結果含量的 RSD=1.56%(n=6)，表明方法的重現性良好。

加樣回收試驗:分別精密稱取氫溴酸樟柳堿對照品0.011 14，0.013 25，0.011 18 g，置 50 mL 容量瓶中，加水適量使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液;精密稱取9份由成都第一制藥有限公司提供的空白輔料1.6 g，置100 mL容量瓶中，加水適量，充分振搖使輔料完全溶解;再精密量取3份對照品貯備液各 4.0，5.0，6.0 mL，分別置上述空白輔料溶液中，加水稀釋至刻度，搖勻，依法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 氫溴酸樟柳堿加樣回收試驗結果(n=9)

2.4 樣品含量測定結果

取3批樣品各2片，剪碎，置10 mL容量瓶中，加水充分振搖使膜完全溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另取干燥至恒重的氫溴酸樟柳堿對照品，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含2 μg的溶液。按照擬訂的色譜條件進行含量測定，結果3批樣品中氫溴酸樟柳堿含量分別為219.83% ，233.04%和 201.27% 。

3 討論

3批樣品的含量測定值較大。通過試驗發現，按現行標準中的配方比所制得的樣品，其氫溴酸樟柳堿定性鑒別反應不明顯，為了適應現行標準，只能增加樣品中氫溴酸樟柳堿的含量。

通過不同流動相的選擇[1－3]，氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品3種組分可以達到完全分離，而且硫酸阿托品的兩種異構體也可以達到基線分離，說明此方法對托烷類生物堿樣品的分離效果較好。通過方法學試驗表明，建立的此方法可以對三維氫溴酸樟柳堿膜中的氫溴酸樟柳堿進行定量檢測。

[1]王 彥.高效液相色譜法測定氫溴酸樟柳堿含量[J].藥物分析雜志，1999，14(4):254－256.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:559－560.

[3]Chen Y，Chen HX，Du P，et al.Analysis of anisodine and identification of twenty of its metabolites in rat urine by liquid chromatography－tandem mass spectrometry[J].Chromatographia，2005，62(11):563 － 569.