腰舒膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

郭 亮 ，郭劍華 ，劉渝松 ，馬善治 ，林 於 ，劉 新，彭文忠 ，王 健 ，廖興隆 ，胡 曉

(1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400010;2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016)

腰舒膠囊由丹參、黨參、當(dāng)歸、川牛膝、狗脊、槲寄生、制川烏、全蝎、熟地黃9味藥材組方，為中藥復(fù)方醫(yī)院制劑，具補(bǔ)肝腎、益氣血、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功效，臨床用于腰椎間盤突出癥祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血，療效顯著。采用薄層色譜(TLC)法對(duì)制劑中的川牛膝、當(dāng)歸、狗脊、黨參、槲寄生、丹參進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定制劑中有效成分丹參酮ⅡA的含量，旨在為該制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

SY－810型高效液相色譜儀(瑞利分析儀器公司);AG135型1/10萬(wàn)天平(Mettler Toledo公司)。腰舒膠囊及各陰性樣品(重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院制備);川牛膝對(duì)照藥材(批號(hào)為121066－200203)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)為120927－200512)、狗脊對(duì)照藥材(批號(hào)為121071－200502)、黨參對(duì)照藥材(批號(hào)為121057－200303)、槲寄生對(duì)照藥材(批號(hào)為121075－200402)、丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)為20041207)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

川牛膝:取膠囊內(nèi)容物20 g，加乙醇100 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯30 mL萃取，棄去乙酸乙酯液，水液繼續(xù)用水飽和的正丁醇30 mL萃取，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含川牛膝的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取川牛膝對(duì)照藥材2 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲醇－濃氨(12∶6∶3∶0.5)為展開劑，濃氨水預(yù)平衡20 min，展開至12～14 cm，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，置紫外光燈(365 nm)下檢視顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)(圖A1－A2)。

當(dāng)歸:取膠囊內(nèi)容物20 g，加乙醇100 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使分散，用石油醚(60～90℃)50 mL萃取，分取石油醚液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含當(dāng)歸的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材2 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10～15 μL、對(duì)照藥材溶液5～10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(10∶1)為展開劑，展開至10～12 cm，取出，晾干，再噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，置紫外光燈(365 nm)下檢視顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)(圖B1－B2)。

狗脊[1]:取膠囊內(nèi)容物20 g，加乙醇100 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使分散，用石油醚30 mL萃取，棄去石油醚液，分取水液，加乙酸乙酯50 mL萃取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含狗脊的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取狗脊對(duì)照藥材2 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各10～15 μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(20∶2)為展開劑，展開至10～12 cm，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，置紫外光燈(365 nm)下檢視顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)(圖C1－C2)。

黨參:取膠囊內(nèi)容物6 g，加正丁醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。取不含黨參的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取黨參對(duì)照藥材2 g，加正丁醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液 10～20 μL、對(duì)照藥材溶液 10～15 μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇－乙醇－水(15∶3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)(圖D)。

槲寄生:取膠囊內(nèi)容物5 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，取濾液，加鹽酸3 mL，加熱回流1 h后濃縮至約10 mL，加水20 mL，用石油醚(60～90℃)萃取3次，每次20 mL，石油醚萃取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含槲寄生的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取槲寄生對(duì)照藥材1.5 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL、對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇(40∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)(圖E)。

丹參[2]:取膠囊內(nèi)容物6 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使分散，用乙醚30 mL萃取，分取乙醚層，低溫蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含丹參的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 ～15 μL、對(duì)照品溶液 10 μL，分別點(diǎn)于同一以 0.3%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無(wú)此斑點(diǎn)(圖F)。

圖1 薄層色譜鑒別圖

2.2 丹參酮ⅡA含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Amethyst C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 水(9 ∶1);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:20 μL。該色譜條件下，理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000，葛根素峰分離良好，陰性無(wú)干擾(見圖2)。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

取膠囊內(nèi)容物7 g，碾細(xì)，精密稱定，用乙醇50 mL回流提取30 min，濾過，殘?jiān)儆?0 mL乙醇超聲處理5 min，濾過，合并濾液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使分散，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，蒸發(fā)皿用30 mL乙醚反復(fù)洗滌，洗滌液并入分液漏斗中，再用60 mL乙醚分兩次萃取，合并乙醚萃取液，蒸干，殘?jiān)眉状挤执问谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，用甲醇制成每1 mL含4 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，用甲醇制成每 1 mL 含 1.0，3.0，4.0，5.0，10.0 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，在選訂的色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以丹參酮ⅡA吸收峰面積積分值為縱坐標(biāo) Y、進(jìn)樣質(zhì)量濃度 X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為 Y=127 210.6 X，r=0.999 6結(jié)果表明，丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度在 1.0 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)與其峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):吸取同一丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄丹參酮ⅡA的峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為 0.27%(n=5)，表明儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一剛制備的供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h在選訂的色譜條件下進(jìn)樣20 μL，記錄丹參酮ⅡA的峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為1.3%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，精密稱定，依法制備5份供試品溶液，在選訂的色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL，記錄丹參酮ⅡA的峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為1.0%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知丹參酮ⅡA含量的樣品6份，精密稱定，分別精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品的甲醇稀釋液，依法制備6份供試品溶液并測(cè)定，記錄丹參酮ⅡA的峰面積積分值。結(jié)果平均回收率為92.8%。

2.3 樣品含量測(cè)定[3]

取中試樣品3批，依法測(cè)定丹參酮ⅡA含量。結(jié)果見表1。

表1 中試樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本制劑當(dāng)中川牛膝、當(dāng)歸、狗脊、黨參、槲寄生、丹參的薄層色譜鑒別方法學(xué)考察表明，薄層色譜斑點(diǎn)分離良好，斑點(diǎn)圓整清晰，陰性無(wú)干擾，同時(shí)試驗(yàn)樣品均能檢出相應(yīng)色譜斑點(diǎn)，表明選訂的方法具有專屬性和重現(xiàn)性，可作為腰舒膠囊制劑質(zhì)量控制的定性檢測(cè)方法。

測(cè)定丹參酮ⅡA含量采用的是高效液相色譜法。供試品甲醇提取后離心取上清液，再用石油醚萃取，溶液澄清，且用此方法制備供試品溶液簡(jiǎn)單、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，供試品溶液中目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5。因此，該方法可用于本制劑質(zhì)量控制的含量測(cè)定方法。

本試驗(yàn)中建立了鑒別制劑中川牛膝、當(dāng)歸、狗脊、黨參、槲寄生、丹參的薄層色譜鑒別方法，能鑒別出其特征性斑點(diǎn);建立了測(cè)定丹參酮ⅡA含量的高效液相色譜法，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均符合要求。因此，上述兩種方法為制訂腰舒膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

[2]周 玲，李桂芳.寧心通痹膠囊丹參和川芎的薄層色譜鑒別[J].中華醫(yī)藥雜志，2009，9(8):56 －58.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:70.