CHLH的ABA受體之爭

任杰 冷平 孫福山 徐秀紅

植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）調(diào)控植物生長和發(fā)育的許多方面，如果實的發(fā)育成熟［1-5］、種子成熟、萌發(fā)和幼苗生長，并且作為一種核心激素通過調(diào)節(jié)氣孔開閉和脅迫響應(yīng)基因的表達來調(diào)控植物適用環(huán)境脅迫，如干旱、鹽害和冷害等［6，7］。作為一種植物激素信號，ABA首先必須被靶細胞質(zhì)膜或內(nèi)膜體系上（或胞液中）所具有的特異受體蛋白所識別，才能經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞等過程，啟動特異的生理生化反應(yīng)，或產(chǎn)生發(fā)育過程的轉(zhuǎn)換［8］，即ABA信號的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始于ABA受體對ABA信號的感知。

ABA受體是ABA信號路徑中最上游的組分，這一研究領(lǐng)域受到了科研工作者的廣泛關(guān)注。近年來，脫落酸受體鑒定工作在模式植物上取得了實質(zhì)性突破。這些受體，一類是細胞質(zhì)膜上常規(guī)的G 蛋白偶聯(lián)受體GCR2 和新型的G 蛋白偶聯(lián)受體GTG1、GTG2［9，10］，另一類是含有 START 特征區(qū)的 ABA 受體 PYR/PYL/RCAR［11-13］，還有一類是定位于質(zhì)體/葉綠體內(nèi)參與葉綠素合成的鎂離子螯合酶H 亞基的ABA 受 體 ABAR/CHLH［14-16］。 本 文 僅 就 CHLH 與ABA信號傳遞的關(guān)系作一綜述。

1 CHLH是否為ABA受體

鎂螯合酶H亞基（CHLH）通過催化鎂卟啉的生成而參與葉綠素合成，還參與介導(dǎo)從葉綠體到細胞核的反向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［17-21］，是一個多功能的蛋白質(zhì)。但是對于CHLH是否為ABA 受體目前仍存在較大爭議。Shen等［14］在擬南芥（Arabidopsis thaliana）上證明CHLH蛋白能與（+）-ABA特異結(jié)合，而且，CHLH-ABA結(jié)合的動力學(xué)符合受體-配體結(jié)合的所有特征。超表達CHLH和RNAi改變了ABA結(jié)合位點的數(shù)量，但是沒有改變其與ABA的親和力。這說明CHLH能特異性結(jié)合ABA，并且這些結(jié)合具備了ABA受體的基本特征。但是Müller和Hansson［22］在大麥（Hordeum vulgare）上的研究指出大麥XanF基因（擬南芥CHLH同源基因）突變導(dǎo)致的葉綠素缺陷突變體在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動方面并沒有ABA相關(guān)表型，并且并沒有檢測到XanF與ABA的結(jié)合活性，這說明大麥CHLH不是ABA受體或者單子葉植物CHLH蛋白在與ABA結(jié)合和信號傳遞方面與雙子葉植物不同。這一研究結(jié)果對CHLH作為ABA受體的結(jié)論提出質(zhì)疑。

針對大麥上的研究結(jié)果，Wu等［15］利用一項新的ABA免疫親和層析技術(shù)提出了CHLH作為ABA受體的新證據(jù)，研究指出，CHLH通過C端半段而非N端半段特異性結(jié)合ABA（圖1）。與此一致，通過轉(zhuǎn)基因操作提供的遺傳學(xué)證據(jù)也支持了這一結(jié)論。通過基因重組技術(shù)在野生型擬南芥中分段表達CHLH C-半端蛋白可以導(dǎo)致植株在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動這3個主要表型上對ABA全面超敏，在ABA不敏感型CHLH突變體cch中表達C端區(qū)段蛋白則能恢復(fù)突變體對ABA的響應(yīng)。而不結(jié)合ABA的N端區(qū)段的作用僅限于調(diào)節(jié)種子萌發(fā)或幼苗生長之其中之一。這些新發(fā)現(xiàn)支持了CHLH是ABA受體的觀點，并說明CHLH C端在ABA信號傳遞過程中發(fā)揮核心功能，其不但是結(jié)合ABA的核心區(qū)域，而且相應(yīng)地也是介導(dǎo)ABA信號的核心區(qū)域。此外Wu等研究發(fā)現(xiàn)大麥和水稻（Oryza sativa）CHLH能夠結(jié)合ABA。基于這些研究結(jié)果，研究認為，之所以沒有檢測到大麥XanF對ABA的特異性結(jié)合，可能是因為放射性ABA測定體系中的蛋白質(zhì)在試驗過程中被訓(xùn)練不足的研究人員全部除去了［15，23］。此外，Shang等［16］將大麥XanF基因?qū)霐M南芥野生型植株，導(dǎo)致植株對ABA超敏，將XanF基因?qū)霐M南芥cch突變體也恢復(fù)了該突變體在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動方面的ABA脫敏表型。這些事實說明，大麥XanF與擬南芥CHLH一樣是一個ABA受體。

但是，Tsuzuki等［24］通過人工誘變的方法獲得了一個擬南芥CHLH突變體rtl1，研究表明rtl1和擬南芥RNAi株系在氣孔運動方面表現(xiàn)對ABA脫敏，但rtl1表型在種子萌發(fā)和根系生長方面仍然對ABA敏感。此外，利用H3標(biāo)記的ABA結(jié)合試驗表明ABA不能與重組的CHLH結(jié)合，但能與另一個公認的ABA受體PYR1特異性結(jié)合。研究指出CHLH影響了ABA介導(dǎo)的保衛(wèi)細胞的氣孔運動，但并未影響種子萌發(fā)和根系生長，因此認為CHLH能夠影響保衛(wèi)細胞對ABA的敏感性，但并不是一個ABA受體，再次對CHLH是ABA受體的結(jié)論提出質(zhì)疑。

圖1 CHLH分子的功能區(qū)域模型［23］

2 CHLH正向調(diào)節(jié)ABA信號是否轉(zhuǎn)導(dǎo)

Shen 等［14］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)上調(diào)或下調(diào)CHLH基因的表達，以及利用CHLH基因點突變的突變體遺傳材料證明CHLH是ABA信號的正調(diào)節(jié)子。CHLH基因表達下調(diào)的擬南芥株系在ABA抑制的種子萌發(fā)、幼苗生長以及ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉方面表現(xiàn)出顯著的ABA不敏感表型。與此相反，CHLH基因表達上調(diào)的擬南芥株系在這3種反應(yīng)方面表現(xiàn)出對ABA超敏表型，并且其葉片和植株更能忍耐干旱脅迫。總的來說，CHLH水平與ABA不敏感表型強度負相關(guān)，這說明CHLH作為一個正調(diào)控因子介導(dǎo)了ABA信號傳遞。此外，通過RNAi下調(diào)CHLH基因的表達，同時也降低了葉片中ABA信號傳遞路徑正調(diào)控因子 RD29A、MYB2、MYC2、ABI4、ABI5 和OST1的表達，促進了3個負調(diào)控因子ABI1、ABI2和CIPK15的表達。種子特異性ABA信號傳遞基因ABI3、ABI4和ABI5及其下游與胚形成有關(guān)的基因EM1和EM6在RNAi植株長角果中的表達都下降。而CHLH超表達株系中這些基因的表達與RNAi株系相反。進一步證明了CHLH是正調(diào)控因子，并且可能通過多種途徑發(fā)揮作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CHLH作為一個蛋白普遍存在于綠色和非綠色組織中。因此，CHLH可能在植物整體水平上感知ABA信號［14］。對草莓果實的研究表明，隨著果實的加速褪綠，F(xiàn)aCHLH基因表達量迅速降低，至白果期降到最低點；隨著果實著色啟動，其表達量又迅速上升。因此認為CHLH基因可能參與果實的褪綠和著色過程。通過 ABA 處理草莓果實圓片溫育試驗表明，隨著ABA 濃度的增加，F(xiàn)aCHLH 表達量呈顯著上升的趨勢，因此認為草莓果實中CHLH 基因的轉(zhuǎn)錄受ABA 誘導(dǎo)，是正調(diào)控因子［25］。

但是與以上研究結(jié)果不同，Ren等［26］從甜櫻桃果實中克隆了一個CHLH同源基因PacCHLH1。PacCHLH1推測的氨基酸序列與擬南芥、桃、草莓和葡萄等的CHLH相應(yīng)片段的同源性都在90％以上，但是PacCHLH1在甜櫻桃果實中的表達模式與CHLH在擬南芥和草莓果實中的表達模式有很大差別。PacCHLH1在甜櫻桃果實中的表達在果實成熟啟動時急劇下降，在果實成熟前4d降至最低值，之后至果實成熟則一直維持在這一低水平，與ABA含量在這一時期的變化表現(xiàn)出相反的趨勢（圖2）。此外，研究表明，外源ABA不但沒有促進反而顯著抑制了PacCHLH1在果實中的表達。這些結(jié)果與CHLH作為葉綠素合成關(guān)鍵酶的性質(zhì)是一致的，在甜櫻桃的成熟過程中，葉綠素含量急劇下降，與PacCHLH1轉(zhuǎn)錄水平變化相一致。此外，ABA能促進葉綠素的分解，而抑制葉綠素合成關(guān)鍵酶基因CHLH的表達。這些結(jié)果說明，PacCHLH1與甜櫻桃果實葉綠素的合成有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，水分脅迫對果實PacCHLH1的表達并無顯著影響，但顯著促進了PacCHLH1在葉片中的表達，PacCHLH1在生殖器官和營養(yǎng)組織中表現(xiàn)出不同的表達模式［26］。這些研究表明，PacCHLH1在果實成熟過程中的表達與ABA表現(xiàn)出相反趨勢，外源ABA抑制了PacCHLH1在果實中的表達，與CHLH作為正調(diào)控因子介導(dǎo)ABA信號傳遞的結(jié)果不一致。但是PacCHLH1又能響應(yīng)葉片水分脅迫，這一結(jié)果與其作為正調(diào)控因子介導(dǎo)ABA信號傳遞的結(jié)果一致。

圖2 甜櫻桃果實成熟過程中PacCHLH1的表達及ABA含量變化［26］

3 CHLH對ABA信號向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制

CHLH是一個葉綠體蛋白，其如何向細胞質(zhì)或通過細胞質(zhì)向細胞核進行信號傳遞成為必須解決的一個問題。Shang等［16］利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細胞生物學(xué)等多種技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)CHLH橫跨在葉綠體被膜上，其C端和N端暴露在細胞質(zhì)中，這就為CHLH從葉綠體向細胞質(zhì)-細胞核傳遞信號提供了可能。進一步的研究表明，暴露在細胞液中的C端部分與一組在種子萌發(fā)和幼苗生長中負調(diào)控ABA信號傳遞的WRKY轉(zhuǎn)錄因子（WRKY40、WRKY18和WRKY60）相互作用，其中WRKY40是核心負調(diào)控因子，抑制下游重要的ABA信號調(diào)節(jié)子基因如ABI4、ABI5、ABF4和MYB2等基因的表達，從而負調(diào)控ABA信號通路。通過一系列遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細胞學(xué)試驗，Shang等［16］提出了CHLH-WRKY40相偶聯(lián)的ABA信號級聯(lián)通路模型。該模型指出，CHLH與ABA信號分子結(jié)合后，可以刺激WRKY40從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，促進CHLH與WRKY40的相互作用，進而激發(fā)一種未知因子（或信號系統(tǒng)），阻遏WRKY40的表達，從而解除WRKY40對ABA響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的抑制，最終實現(xiàn)ABA的生理效應(yīng)（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)描述了一條從早期信號事件到下游基因表達的ABA信號路徑。

4 小結(jié)

綜上所述，有關(guān)CHLH作為ABA受體的研究還是集中在種子萌發(fā)、幼苗生長及對環(huán)境脅迫方面，且均是以傳統(tǒng)遺傳學(xué)技術(shù)為研究手段，研究結(jié)果不盡相同，至今仍存在較大爭議。有關(guān)CHLH空間結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域功能的研究，特別是結(jié)合ABA 的結(jié)構(gòu)域的研究還未見報道。要想徹底闡明CHLH是否為ABA受體，需在CHLH的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方面取得進展，以便在亞分子水平上深入揭示CHLH結(jié)合ABA和感知ABA信號的機制。

圖3 CHLH介導(dǎo)的信號傳遞模型［23］

［1］ Coombe BG, Hale CR.Thehormone content of ripening grape berries and the effects of growth substance treatments［J］.Plant Physiol,1973, 51：629-634.

［2］ Kondo S, Gemma H.Relationship between abscisic acid（ABA）content andmaturation of the sweet cherry［J］.J Jpn Soc Hortic Sci, 1993, 62：63-68.

［3］ Zhang M, Yuan B, Leng P.The role of ABA in triggering ethylene biosynthesis and ripening of tomato fruit［J］.J Exp Bot, 2009, 60：1579-1588.

［4］ Zhang M, Leng P, Zhang GL, et al.Cloning and functional analysis of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）genes encoding a key enzyme during abscisic acid biosynthesis from peach and grape fruits［J］.J Plant Physiol, 2009, 166：1241-1252.

［5］ 任杰, 冷平.ABA和乙烯與甜櫻桃果實成熟的關(guān)系［J］.園藝學(xué)報 , 2010, 37（2）：199-206.

［6］ Finkelstein RR, Gampala S, Rock C.Abscisic acid signaling in seeds and seedlings［J］.Plant Cell, 2002, 14：S15-S45.

［7］ Adie BA, Pérez-Pérez J, Pérez-Pérez MM, et al.ABA is an essential signal for plant resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis［J］.Plant Cell, 2007, 19：1665-1681.

［8］ Wang XF, Zhang DP.Abscisic acid receptors：multiple signal perception sites［J］.Ann Bot, 2007, 101：311-317.

［9］ Liu X, Yue Y, Li B, et al.A G protein-coupled receptor is a plasmamembrane receptor for the planthormone abscisic acid［J］.Science, 2007, 315：1712-1716.

［10］ Pandey S, Nelson DC, Assmann SM.Two novel GPCR-type G proteins are abscisic acid receptors in Arabidopsis［J］.Cell,2009, 136：136-148.

［11］ Fujii H, Chinnusamy V, Rodrigues A, et al.In vitro reconstitution of an abscisic acid signaling pathway［J］.Nature, 2009, 462：660-664.

［12］ Ma Y, Szostkiewicz I, Korte A, et al.Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors［J］.Science, 2009, 324：1064-1068.

［13］ Park SY, Fung P, Nishimura N, et al.Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins［J］.Science, 2009, 324：1068-1071.

［14］ Shen YY, Wang XF, Wu FQ, et al.The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor［J］.Nature, 2006, 443：823-826.

［15］ Wu FQ, Xin Q, Cao Z, et al.Themagnesium-chelatase H subunit binds abscisic acid and functions in abscisic acid signaling：new evidence in Arabidopsis［J］.Plant Physiol, 2009, 150：1940-1954.

［16］ ShangY, Yan L, Liu ZQ, et al.The Mg-chelatase H subunit of Arabidopsis antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition［J］.Plant Cell,2010, 22：1909-1935.

［17］ Gibson LCD, Marrison JL, Leech RM, et al.A putative Mg chelatase subunit from Arabidopsis thaliana cv C24.Sequence and transcript analysis of the gene, import of the protein into chloroplasts, and in situ localization of the transcript and protein［J］.Plant Physiol,1996, 111：61-71.

［18］ Guo RB, Luo MZ, Weinstein JD.Magnesiumchelatase from developing pea leaves［J］.Plant Physiol, 1998, 116：605-615.

［19］ Papenbrock J, Mock HP, Tanaka R, et al.Role ofmagnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway［J］.Plant Physiol, 2000, 122：1161-1170.

［20］ Mochizuki N, Brusslan JA, Larkin R, et al.Arabidopsis genomes uncoupled 5（GUN5）mutant reveals the involvement of Mgchelatase H subunit in plastid-to-nucleus signal transduction［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98：2053-2058.

［21］ Nott A, Jung HS, Koussevitzky S, Chory J.Plastid-to-nucleus retrograde signaling［J］.Annu Rev Plant Biol, 2006, 57：739-759.

［22］ Müller AH, Hansson M.The barleymagnesium chelatase 150-kD subunit is not an abscisic acid receptor［J］.Plant Physiol, 2009,150：157-166.

［23］ 張大鵬.始于質(zhì)體/葉綠體的ABA信號通路［J］.植物學(xué)報,2011, 46（4）：361-369.

［24］ Tsuzuki T, Takahashi K, Inoue S.Mg-chelatase H subunit affects ABA signaling in stomatal guard cells, but is not an ABA receptor in Arabidopsis thaliana［J］.J Plant Res, 2011, 124：527-538.

［25］ 賈海鋒, 柴葉茂, 李春麗, 等.草莓果實中脫落酸受體基因FaABAR/CHLH 表達變化及其影響因素分析［J］.園藝學(xué)報,2011, 38（9）：1650-1656.

［26］ Ren J, Sun L, Wang CL, et al.Expression analysis of the cDNA formagnesium chelatase H subunit（CHLH）during sweet cherry fruit ripening and under stress conditions［J］.Plant Growth Regulation, 2011, 63：301-307.