熒光定量PCR法檢測線粒體基因A1555G與C1494T突變

林文津 郭舜民 徐榕青 肖志勇 張亞敏

1.福建省醫(yī)學科學研究院 福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建福州 350001；2.福建省福州市第二醫(yī)院，福建福州 350007

線粒體12SrRNA基因是氨基糖苷類抗生素導致的非綜合征型聽力損失的一個突變熱點區(qū)域。由于A1555G和C1494T突變在12SrRNA基因形成G-C和U-A配對使得與氨基糖苷類抗生素的結合更加容易，這就是為何攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖苷類抗生素時會出現(xiàn)或加重耳聾的原因[1]。因此，對這兩個點突變的檢測，對于預防氨基糖苷類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意義。目前關于線粒體耳聾基因的檢測方法有多種，文獻已報道的方法有酶切法[2-3]、直接測序法[2-6]、基因芯片法[7-10]、實時熒光定量Taqman探針法[11]等。檢測的突變熱點主要是1555、1494、961等[12-13]。本次試驗采用熒光定量PCR法檢測95例非綜合征藥源性耳聾患者及其家屬線粒體基因A1555G、C1494T突變，并采用傳統(tǒng)的毛細管電泳測序法進行確證，現(xiàn)將檢測結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

95例非綜合征型耳聾患者及其家屬均為漢族，其中，男44例 女51例，聾病先證者54例（男39例，女15例）。經(jīng)知情同意后，首先對先證者及其家屬進行病史調(diào)查，包括家族史、耳聾史及耳毒性藥物的使用情況等，同時進行純音聽域測試，明確先證者均為非綜合征型耳聾。

1.2 儀器與試劑

PCR擴增儀（Bio-Rad公司）；ABI 3130測序儀、ABI 7500熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）。Taq酶、dNTP（北京百泰克生物技術有限公司）；測序引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）；藥物性耳聾基因突變檢測試劑盒及陽性對照試劑（智海生物工程北京有限公司）。

1.3 全血基因組DNA提取

用枸櫞酸鈉抗凝的一次性采血管，取受檢者的外周靜脈血約2 mL，采用離心吸附柱法按照血液基因組DNA提取試劑盒的操作說明書操作，提取受檢者全血基因組DNA，用瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測。所提取的DNA條帶清晰，完整性好，紫外分光光度計檢測DNA 濃度約為 50 ng/μL。

1.4 熒光定量PCR檢測

取出試劑盒中擴增反應液，解凍后取18 μL，再加入2 μL提取得到的DNA或?qū)φ掌啡芤海靹?，然后上機進行檢測。溫度循環(huán)程序分4個步驟：①37℃5 min，1 個循環(huán)；②95℃ 15 min，1 個循環(huán)；③95℃ 15 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)；④95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15s，60℃ 15 s，1 個循環(huán)，進行熔解曲線分析。

1.5 mtDNA測序

1.5.1 PCR反應 PCR引物根據(jù)從 NCBI下載的人線粒體基因組序列，利用Gene Tools軟件自行設計，所設計引物的PCR產(chǎn)物為線粒體1262～1772位點，共計511 bp，能同時檢測1494與1555位點的突變。PCR反應體系見表1。PCR程序：①94℃ 5 min，1個循環(huán)；②94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個循環(huán)；③72℃ 10 min，1 個循環(huán)。

表1 PCR反應體系

1.5.2 測序 將PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)方法制備成測序模板后用傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法在ABI 3130測序儀上測序分析。

2 結果

2.1 熒光定量PCR檢測結果

除空白對照組外，各反應管均出現(xiàn)特異性擴增，各PCR產(chǎn)物的Tm值之間均能很好的進行區(qū)分（大于2℃），1494T 標準對照管出現(xiàn) 78.2℃和 84.5℃的熔解峰，分別為1494T和質(zhì)控峰（圖1A）；1555G標準對照管主要出現(xiàn)74.9℃和84.1℃的熔解峰，分別為1555G和質(zhì)控峰（圖 1B）；1555G陽性患者出現(xiàn) 75.7℃和84.8℃的熔解峰，分別為 1555G 和質(zhì)控峰（圖 1C）；正常人僅出現(xiàn)1個84.2℃的熔解峰，為質(zhì)控峰（圖1D）；以無菌雙蒸水為模板的空白對照為一直線，未見熔解峰（圖1E）。綜合上述檢測結果，可以判定在75℃附近出現(xiàn)熔解峰，說明有A1555G突變，在78℃出現(xiàn)熔解峰，說明有C1494T突變，正常人僅在84℃附近出現(xiàn)熔解峰。

根據(jù)上述判定方法，本試驗共發(fā)現(xiàn)4例A1555G突變患者，占先證者7.41%，占高危人群（先證者及其家屬）4.26%，未發(fā)現(xiàn)C1494T突變患者，見表2。采用PASWSTAT統(tǒng)計軟件，經(jīng)交叉表McNemar檢驗分析，P=1.000，說明兩種方法檢測效果相同。

圖1 熒光定量PCR法檢測的熔解曲線圖

表2 熒光定量PCR法與測序法檢測結果比較（例）

2.2 線粒體基因序列分析

運用GeneTools軟件將測序結果與NCBI網(wǎng)站上公布的人線粒體基因標準序列比對，結果顯示僅這4例陽性患者線粒體基因發(fā)生了線粒體基因 A1555G突變。所有檢測結果均與所測標本的真實結果一致，從而驗證了本方法是準確有效的。結果提示，線粒體基因A1555G突變可能是這4例患者非綜合征耳聾遺傳易感性的分子基礎。查閱患者病例資料發(fā)現(xiàn)，該4例A1555G陽性患者雙耳均出現(xiàn)了不同程度的聽力損傷，且均為女性，其中兩位為母女關系，這也從側面反映了藥源性耳聾這一線粒體病呈現(xiàn)出母系遺傳的特點。

3 討論

氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等，因其對革蘭陰性菌的感染特別有效，同時對于某些革蘭陽性菌也有協(xié)同抗菌作用，在臨床上仍在廣泛使用。此外，疫苗是另一個潛在的危險因素，大多數(shù)人并不知道疫苗中含有氨基糖苷類抗生素，如國家計劃免疫的麻疹疫苗中含有新霉素，水痘疫苗中含有新霉素，甲流疫苗中含有硫酸慶大霉素。線粒體基因突變與藥源性耳聾的關系研究的比較清楚，突變攜帶者就是藥源性耳聾的敏感個體。藥源性耳聾尚無有效治療方法，唯一的辦法就是預防。通過基因檢測，發(fā)現(xiàn)基因突變的攜帶者，盡早干預，可以預防藥源性耳聾的發(fā)生。

本試驗采用特異引物延伸技術結合實時熒光定量PCR技術，通過PCR產(chǎn)物Tm值的差異來實現(xiàn)多位點突變的檢測，當有突變型核酸存在的情況下，針對突變型設計的序列特異性引物得到延伸產(chǎn)生特定的PCR產(chǎn)物，同時在每個反應體系中加入了熒光物質(zhì)，擴增完成后，熒光物質(zhì)結合到PCR產(chǎn)物中，在進行熔解曲線分析后，不同的PCR產(chǎn)物將產(chǎn)生不同的熔解峰（即熔解峰所對應的溫度值不同），從而達到一個反應同時檢測兩個突變的結果。所購買的試劑盒中未提供陽性對照，由該公司另行提供。為方便判斷C1494T和A1555G突變的熔解峰峰位，本試驗將2個陽性標準對照分別檢測，發(fā)現(xiàn)1555G突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在75℃，1494T突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在78℃；結果圖1B中1555G熔解曲線除了出現(xiàn)特異性產(chǎn)物熔解峰外還出現(xiàn)了較多的雜峰，可能與該公司提供的標準對照濃度太低有關，但不影響實驗結果的判定。

對藥源性耳聾基因突變的檢測方法，除本實驗應用的方法外，還有直接測序法、實時熒光定量Taqman探針法、耳聾基因芯片法、酶切法等。直接測序法雖然是鑒定突變的金標準，但操作繁瑣、需專門的培訓，結果判讀復雜。Taqman探針法與本方法比較，雖然用的均為熒光定量PCR儀，但本法能在一管中實現(xiàn)兩個位點的檢測，成本低廉、結果判讀容易。目前芯片方法需要1次同時檢測9個常見耳聾基因突變位點，成本較高，不適合單獨針對藥源性耳聾患者的臨床篩查。酶切法雖然不需要用到熒光定量PCR儀，但操作較復雜，特異性差，需跑電泳（電泳膠需要額外配制，而且含致癌物質(zhì)），容易污染。本實驗儀器要求簡單，費用低，操作簡單，無需酶切或電泳，同時整個過程除加入模板外無需進行開蓋操作，有效避免污染的產(chǎn)生，能夠簡單、快速、準確的實現(xiàn)2個點突變的同時檢測或單獨檢測。

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