SIRT1高表達(dá)在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的神經(jīng)保護(hù)作用1）

司沛沛，孫雪菲，楊小榮，張 策

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在胚胎期神經(jīng)發(fā)育、腦的興奮性突觸傳遞、突觸可塑性方面發(fā)揮了重要作用。但是，谷氨酸過(guò)度聚集可引起細(xì)胞損傷甚至死亡，稱(chēng)為興奮性神經(jīng)毒，興奮性神經(jīng)毒模型是最常用、最具毒性、損傷機(jī)制最復(fù)雜、最具臨床意義的一個(gè)神經(jīng)損傷模型，它參與多種神經(jīng)病理過(guò)程，如腦缺血損傷、各種神經(jīng)退行性疾病等［1，2］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去乙酰化酶Sirtuin蛋白家族成員，作為一種NAD＋依賴(lài)的脫乙酰基酶，它與組蛋白乙酰基酶共同維持細(xì)胞核的乙酰化平衡。SIRT1以組蛋白和多種非組蛋白作為底物，通過(guò)其去乙酰化作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、染色體穩(wěn)定性和靶蛋白活性，進(jìn)而參與能量代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。近年來(lái)，有關(guān)SIRT1的神經(jīng)保護(hù)作用受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。為進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT1可能具有的廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用，本研究擬采用NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒細(xì)胞模型，應(yīng)用（cell counting Kit－8）CCK－8分析、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)、Western－blot等方法，明確SIRTI高表達(dá)在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SH－SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；NMDA試劑購(gòu)自sigma公司；CCK－8購(gòu)自Dojindo；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti－MEM無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；MEM、F12培養(yǎng)基，Commassie改良增強(qiáng)型蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自全式金生物有限公司；兔抗人SIRT1抗體購(gòu)自Abcam公司；β－actin山羊抗兔二抗購(gòu)自中杉金橋；Super ECL Plus超敏發(fā)光液購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH－SY5Y培養(yǎng)基為 MEM、F12，含有10%胎牛血清，100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素。將細(xì)胞以1×105的細(xì)胞濃度接種于孔板或培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于37℃，5%CO2條件下，每3天以1∶2傳代一次。

1.2.2 NMDA毒性誘導(dǎo) 采用 NMDA（500μmol／L）和甘氨酸（10μmol／L）共孵育2h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10h，再進(jìn)行后續(xù)的CCK－8、LDH測(cè)定以及蛋白提取。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒后，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)入SH－SY5Y細(xì)胞中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和lipo2000以1∶2.5混合后，加入無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h后更換為全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h～36h，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高。

1.2.4 CCK－8的測(cè)定 將培養(yǎng)在96孔板中的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24h后，加入NMDA進(jìn)行毒性誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后每孔加入CCK－8 10μL，37℃避光培養(yǎng)2h，上酶標(biāo)儀測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)650nm。

1.2.5 乳酸脫氫酶釋放檢測(cè) 將培養(yǎng)在六孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后 ，加入NMDA進(jìn)行毒性誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行LDH活性檢測(cè)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)與分析 利用Commassie法測(cè)定蛋白濃度。用10%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用0.3%明膠中室溫封閉1h，加入一抗SIRT1（1∶5 000）、β－actin（1∶3 000）4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1.5h。洗膜后加入ECL超敏發(fā)光液，曝光拍照，用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。β－actin條帶作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT1蛋白水平的改變 Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，SIRT1過(guò)表達(dá)組中SIRT1含量上調(diào)，增加1.15倍（P＜0.05）；空質(zhì)粒組、lipo2000組未影響SIRT1的表達(dá)水平（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 SIRT1表達(dá)水平的改變

2.2 SIRT1高表達(dá)對(duì)NMDA引起的細(xì)胞活力下降的作用將構(gòu)建的SIRT1表達(dá)載體轉(zhuǎn)入SH－SY5Y細(xì)胞中24h后，加入NMDA（500μmol／L）作用2h，繼續(xù)孵育12h后采用CCK－8檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，而SIRT1高表達(dá)可有效抑制NMDA引起的細(xì)胞活力下降，使其活力恢復(fù)60.95%（P＜0.05）；與正常組相比，lipo2000、SIRT1組對(duì)細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 SIRT1高表達(dá)對(duì)NMDA引起的細(xì)胞活力下降的觀察

2.3 SIRT1高表達(dá)對(duì)NMDA引起的LDH釋放的作用 在LDH實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NMDA組的LDH水平增高了59.45%（P＜0.05）；SIRT1高表達(dá)使NMDA誘導(dǎo)釋放的LDH減少24.26%（P＜0.05）；lipo2000、SIRT1組對(duì)LDH 的釋放無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖3。

圖3 SIRT1高表達(dá)對(duì)NMDA引起的LDH釋放的作用

3 討 論

谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)在突出間隙中過(guò)度積聚時(shí)，可以激活突出后膜NMDA受體，使胞外Ca2＋內(nèi)流，激活多種蛋白酶，過(guò)度產(chǎn)生自由基，這些因素共同作用，引起神經(jīng)元損傷甚至死亡，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒效應(yīng)［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，熱量限制（calorie restriction，CR）可以延長(zhǎng)酵母及嚙齒動(dòng)物壽命，推遲哺乳動(dòng)物年齡相關(guān)的疾病如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病的發(fā)生，可能正是通過(guò)增加去乙酰化酶Sirtuin活性而起作用。這類(lèi)蛋白修飾酶最初是在酵母中發(fā)現(xiàn)，被稱(chēng)為沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator 2，Sir2）。隨后，人們?cè)诓溉閯?dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了具有廣泛去乙酰化作用的Sir2編碼蛋白。在哺乳動(dòng)物基因組中，目前證實(shí)存在7種Sir2同系物（SIRTs 1－7），其中SIRT1是氨基酸序列最接近Sir2的同系物。SIRT1可能通過(guò)其去乙酰化酶活性參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，如抑制糖酵解、維持血糖穩(wěn)定、防止脂肪變性等。最新研究表明，SIRT1高表達(dá)后通過(guò)其去乙酰化作用，激活不同信號(hào)通路可防止心肌肥大，血栓形成以及血管平滑肌的肥大。

在多種神經(jīng)損傷模型，如腦缺血性損傷模型、AD大鼠模型、HD小鼠模型、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）和脊髓和延髓肌萎縮癥（SBMA）模型，通過(guò)上調(diào)SIRT1增加其去乙酰化酶活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在p25轉(zhuǎn)基因鼠，SIRT1過(guò)表達(dá)可以顯著對(duì)抗神經(jīng)退行性病；在猴的阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）動(dòng)物模型中，高表達(dá)SIRT1能減少腦內(nèi)的β淀粉樣蛋白（amyloid－β，Aβ），且腦內(nèi) Aβ含量與同一區(qū)域的 SIRT1含量呈負(fù)相關(guān)［4］。隨后離體、在體PD模型中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SIRT1可促進(jìn)α－synuclein蛋白降解，減緩神經(jīng)變性［5］。Parker和他的同事們已在線蟲(chóng)中證明，過(guò)表達(dá)SIRT1可以抑制HTT突變引起的神經(jīng)元死亡［6］；在轉(zhuǎn)基因小鼠HD模型中，將SIRT1過(guò)表達(dá)可以使小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力得到顯著改善，并減輕外周神經(jīng)及紋狀體神經(jīng)元的損傷［7，8］。將SIRT1基因轉(zhuǎn)染至原代神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SIRT1可以拮抗由SOD1突變引起的神經(jīng)毒性作用。SIRT1高表達(dá)在多種疾病損傷模型中可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中利用NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒模型，觀察SIRT1高表達(dá)在NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)在突出間隙中過(guò)度積聚時(shí)，可以激活突出后膜NMDA受體，使胞外Ca2＋內(nèi)流，激活多種蛋白酶，過(guò)度產(chǎn)生自由基，這些因素共同作用，引起神經(jīng)元損傷甚至死亡，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，利用脂質(zhì)體lipo2000介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，加入NMDA誘導(dǎo)損傷，采用CCK－8、LDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SIRT1高表達(dá)可以拮抗NMDA神經(jīng)毒性損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加，LDH釋放減少。

而上述保護(hù)效應(yīng)由SIRT1對(duì)底物P5 3、FOXOs、Ku7 0、PGC－1α、TAFI68、P300、PCA 等 的 去 乙 酰 化 作 用 介 導(dǎo) 的［9，10］。相應(yīng)實(shí)驗(yàn)觀察顯示，SIRT1可以通過(guò)使P53去乙酰化，從而負(fù)性調(diào)節(jié)其活性，使細(xì)胞免于凋亡，繼續(xù)分裂生長(zhǎng)；SIRT1通過(guò)使凋亡激活蛋白FOXOs去乙酰化而抑制其轉(zhuǎn)錄，使神經(jīng)元免于凋亡［11］；SIRT1可以使NF－κB亞基p65的賴(lài)氨酸310位點(diǎn)去乙酰化而降低其活性，防止細(xì)胞損傷；SIRT1通過(guò)使HSF1（heat shock factor 1，HSF1）去乙酰化，促進(jìn)HSF1與Hsp70啟動(dòng)子結(jié)合，激活 Hsp70，減少細(xì)胞凋亡［12］。

本實(shí)驗(yàn)表明，在NMDA引起的神經(jīng)毒過(guò)程中，SIRT1作用可能受到抑制，介導(dǎo)神經(jīng)損傷，SIRT1高表達(dá)證實(shí)了可以拮抗NMDA引起的細(xì)胞損傷作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但是，SIRT1具體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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