響應面法優化紫甘薯花色苷水解條件

代 鳳，毛建霏

1中國石油化工股份有限公司貴州石油分公司，貴陽 550002;2四川省農業科學院分析測試中心農業部食品質量監督檢驗測試中心，成都 610066

近年來的研究表明，除作為天然色素外，花青素具有多種對人體有益的生理功能，引起人們廣泛的關注。花青素在自然界以糖苷化的花色苷形式廣泛存在，已鑒定出上千余種。花青素苷元已發現二十余種，常見的僅有六種。紫甘薯富含花青素類色素，主要為酰基化的矢車菊和芍藥素糖苷，已鑒定出二十余種花色苷，具有優異的穩定性和有益的生理功能［1］。使用紫外分光光度法可方便地對總花青素含量進行測定，但影響因素較多［2］。采用高效液相色譜法大多是定性分析，直接定量測定需要液質聯用等復雜儀器和多種標準品，難以應用于實際檢測工作［3］。通過水解多種花色苷為少數花青素苷元，可方便地使用高效液相色譜法對花青素進行準確定性和定量分析［1］。目前僅有通過一次改變一個變量(one variable at a time，OVAT)的方法優化紫甘薯花色苷水解條件的報道，主要影響因素為溫度、鹽酸濃度和水解時間［1，4］。OVAT優化不僅耗時，并且當影響因素之間有交互作用時，得到的結果往往是局部最優，具有一定的局限性［5］。響應面法同時改變多個變量，以回歸方程作為函數估算的工具，考察各因素及其交互作用對響應值的影響，更加準確方便［5］。本文首次使用響應面法對影響紫甘薯花色苷水解的因素進行了考察，采用3因素3水平Box-Behnken中心組合設計，優化了水解時間、鹽酸濃度和水解溫度對響應值(矢車菊素和芍藥素峰面積之和)的綜合影響，從而可以使用高效液相色譜法更加準確快速地測定紫甘薯花青素苷元含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

紫甘薯干粉購于當地市場。

1.1.2 試劑

矢車菊素(Chromadex，標準品，純度95.7%);芍藥素(Chromadex，標準品，純度92.5%);濃鹽酸(西隴化工，優級純，36% ～38%);乙腈(Fisher Scientific，HPLC 純);甲酸(TEDIA，HPLC 純);試驗用水均為去離子水。

1.1.3 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent G1314B多波長紫外檢測器;電子天平(Mettler，AE240);試驗室超純化水機(艾科浦，ACD1-2005-U);高速冷凍離心機(湖南星科科學儀器有限公司，TGL-16LM);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司，DZKW);旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠，XW-80A)。

1.2 紫甘薯花色苷水解條件

取紫甘薯干粉樣品10 g于250 mL磨口錐形瓶，加入0.1 mol/L鹽酸水溶液200 mL，超聲提取半小時后8000 rpm離心5 min后取上清液備用。取1.00 mL紫甘薯花色苷提取液于25 mL磨口具刻度比色管，加入一定體積的濃鹽酸后用水定容至10.0 mL，渦旋混勻。垂直置于水浴鍋中加熱，液面高于10mL刻度線。水解一定時間后立即流水冷卻，定容至25.0 mL并搖勻。在4℃，8000 rpm離心5 min后，直接取上清液用高效液相色譜儀進行分析。整個水解和冷卻過程在室內弱光條件下進行。

圖1 矢車菊和芍藥素標準溶液(a)及紫甘薯樣品(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard solution of cyanidin and peonidin(A)and purple sweet potato sample(B)

1.3 液相色譜條件

色譜柱:waters SunFire C18，5 μm，4.6 × 250 mm;柱溫:30℃;檢測器及波長:525 nm;流動相條件:1%甲酸/水溶液+1%甲酸/乙腈溶液=82+18(體積比)，流速 0.8 mL/min，等度洗脫 10 min。該條件下典型標樣和樣品色譜圖見圖1。

1.4 試驗設計與數據分析

使用統計軟件(Design-Expert 8.0.6)對響應面法優化紫甘薯花色苷水解條件進行試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 紫甘薯花色苷水解影響因素及水平選擇

已有一些報道證明花青素苷元在強酸條件下能夠耐受高溫水解［6-8］。國內外少數關于紫甘薯花青素水解條件的報道均為 OVAT 優化［1，4］，影響花色苷水解的條件主要因素有水解溫度、時間和鹽酸濃度［9］。Van-Den Truong等使用 3.6 mol/L 的鹽酸，100℃在液相色譜進樣瓶中水解60 min［1］;毛建霏等使用3 mol/L的鹽酸，100℃在磨口錐形瓶中水浴水解60 min［4］;在前期的工作中，我們發現鹽酸濃度、水解時間和水解溫度具有顯著地相關性。水解時間隨著鹽酸濃度和水浴溫度的提高縮短。當水浴溫度低于100℃時或者需要水解時間小于60 min時，鹽酸濃度需要進一步加大。為節約試劑并提高處理通量，使用25 mL比色管而不使用磨口錐形瓶。采用Box-Behnken中心組合設計，選擇水解溫度、水解時間和濃鹽酸濃度3個因素，每個因素3個水平，試驗因素及水平見表1。

表1 試驗因素及水平設計表Table 1 Independent Variables and Levels for Optimization

表2 3因素3水平Box-Behnken中心組合設計試驗方案及結果Table 2 Experimental design and results of the three-levelthree-variable Box-Behnken central composition design

2.2 響應面分析試驗設計方案

矢車菊和芍藥素峰面積響應值的變化趨勢基本一致［6］，因此以 A、B、C 為自變量，以矢車菊和芍藥素的峰面積之和為響應值(Y)，進行響應面分析試驗。試驗方案及結果見表2。

2.3 二次響應面回歸模型的建立與方差分析

對表2的結果進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型:

式1中，Y為矢車菊和芍藥素的峰面積之和，β0，βi，βii，βij分別為常數項、一次項系數、二次項系數和相關項系數，X1，X2，X3分別對應因素 A，B，C。得出二次方程:

各因素的方差分析見表3。從表3可以看出，模型的 F值為91.40，其是噪音造成的概率小于0.01%，說明該模型是顯著的。包括各因素一次項、二次項及其相互間的交互作用項(圖2)均為顯著(＜0.05)。失擬性非顯著(＞0.05)說明該二次模型對于當前研究是有效的。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

圖2 水解時間(min)、鹽酸濃度(mol/L)、水解溫度(℃)對紫甘薯花青素峰面積影響的響應面曲線:(a)水解時間和鹽酸濃度;(b)水解溫度和鹽酸濃度;(c)水解時間和水解溫度Fig.2 Response surface plots on the sum of peak area of anthocyanidins in PSP as affected by hydrolysis time(min)，HCl concentration(mol/L)and hydrolysis temperature(℃):(a)hydrolysis time and HCl concentration at constant hydrolysis temperature;(b)hydrolysis temperature and HCl concentration at constant hydrolysis time;(c)hydrolysis time and hydrolysis temperature at constant HCl concentration

2.4 模型確認

應用響應面設計法優化出最佳水解條件為:時間45.8 min，鹽酸濃度 4.54 mol/L，水浴溫度 100℃，得到的花青素峰面積預測值為374.1。為驗證RSA法的可靠性，在優化條件下進行了3次紫甘薯花色苷水解，得到花青素峰面積值為360.9，為理論預測值的96.5%，RSD=0.77%。為進行比較，也采用前期OVAT優化條件(3 mol/L鹽酸，100℃水浴水解60 min)對紫甘薯花色苷進行水解，得到的花青素峰面積值為324.6。RSA法優化得到的條件比前期OVAT優化條件得到的峰面積提高了11%，并且水解時間也有所減少，說明OVAT優化得到的結果只是局部最優。因此將RSA方法應用于紫甘薯花色苷水解優化可以在減少試驗次數的同時，得到準確可靠的優化結果。

3 結論

響應面法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法，避免了OVAT和正交設計等傳統方法只能處理離散的水平值，而無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷。采用3因素3水平Box-Behnken中心組合設計，優化了水解時間、鹽酸濃度和水解溫度對花青素峰面積之和的綜合影響，得到紫甘薯花色苷的最佳水浴水解條件為:水解時間45.8 min，鹽酸濃度4.54 mol/L，水浴溫度100℃。在最優條件下進行驗證試驗，響應值為理論值的96.5%，與理論值基本相符，并高于OVAT方法優化得到的結果，說明該響應面法優化方法可行。

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3 Tian Q，Konczak I，Schwartz SJ.Probing anthocyanin profiles in purple sweet potato cell line(Ipomoea batatas L.Cv.Ayamurasaki)by high-performance liquid chromatography and electrospray ionization tandem mass spectrometry.J Agric Food Chem，2005，53:6503-6509.

4 Mao JF(毛建霏)，Zhou H(周虹)，Lei SR(雷紹榮)，et al.Detection of anthocyanins content in purple sweet potato by high performance liquid chromatography.Southwest China J Agric Sci(西南農業學報)，2012，25:123-127.

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6 Pinho C，Melo A，Mansilha C，et al.Optimization of conditions for anthocyanin hydrolysis from red wine using response surface methodology(RSM).J Agric Food Chem，2010，59:50-55.

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8 Nyman NA，Kumpulainen JT.Determination of anthocyanidins in berries and red wine by high-performance liquid chromatography.J Agric Food Chem，2001，49:4183-4187.

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