決明查爾酮合成酶的同源模建和分子模擬對接

李云雙，周 虹，鐘德馨，方袁夢夢，王萬軍，廖 海，周嘉裕

西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031

類黃酮物質是一類重要的植物次級代謝產物，在植物花色形成、植物育種、抵抗紫外線輻射、防止病原微生物侵染中都發揮了重要作用。并且，類黃酮物質還具有預防心血管疾病、抗癌、調節免疫、抗衰老、抗菌、抗炎等多種生物活性，是一些藥用植物的主要活性成分［1］。查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS，EC 2.3.1.74)是植物中類黃酮物質合成途徑的關鍵酶，是調控植物類黃酮物質合成的關鍵基因之一。CHS催化該途徑的第一步，即丙二酰單酰CoA和香豆酰CoA縮合形成具有C15骨架的黃酮類化合物-查爾酮。此中間物的異構化和功能基團的進一步取代都能導致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成。目前，已從多種植物中克隆了CHS基因，包括蘭花、矮牽牛、擬南芥、金魚草和歐洲赤松等［2］。但是，迄今為止僅有苜蓿(Medicago sativa)中的CHS有X-ray晶體結構報道，并用于CHS催化機制的研究［3］。

決明(Senna tora)為豆科草本植物，其干燥成熟種子被稱為決明子。決明子是一種常用的中藥，有效成分主要是蒽醌類及黃酮類化合物［4］。鑒于CHS在植物生理生化活動中的重要性，有關CHS結構、催化機理及分子工程的研究已成為植物生理生化及分子生物學研究的熱點之一。本課題組在前期研究中已獲得決明CHS基因的全長cDNA序列［5］。在此基礎上，本文利用已有苜蓿CHS晶體結構為模板進行決明CHS三維結構的同源建模，并對獲得的三維結構模型進行動力學模擬和合理性驗證，再將該模型與香豆酰CoA、丙二酸單酰CoA進行分子對接，為利用此類CHS三維模型研究其催化機理和分子工程改造奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 序列比對和同源模建

決明CHS的一級序列(編號:ACB78187.1)來源于NCBI數據庫。在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的PDB數據庫(http://www.rcsb.org/pdb)中用protein blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)方法搜尋同源性和一致性較高且已知晶體結構的蛋白為模板。利用Discovery StudioTM(DS)2.5(Accelrys，San Diego，USA;http://accelrys.com/products/discovery-studio/)的 Align Multiple Sequence模塊對決明CHS進行二級結構預測并與苜蓿CHS進行序列比對。然后將目標與模板序列提交到自動建模服務器SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)，得到初始模型。利用DS的Proteins Superimposing模塊疊合決明CHS與苜蓿CHS的三維結構。

1.2 初始模型的能量優化與修正

采用分子動力學計算能量最小化的方法來優化不利的非共價接觸，保持正確的肽鍵構型及能量最低狀態。本文選用Discovery StudioTM(DS)2.5的能量最小化(EM)和分子動力學模擬(DM)模塊對初始模型進行能量優化，力場為CHARMm力場。能量優化的步驟為:(1)Minimization_1:考慮到溶劑化效應，首先將初始模型放入正立方體的TIP3P水模型中溶解，對整個體系采用1000步最陡下降法(Steepest Descent)優化;(2)Minimization_2:應用5000步共軛梯度法(Conjugate Gradient)進一步優化;(3)Heating:從50 K到300 K梯度進行5 000步的動態模擬;(4)Equilibration:在熱力學溫度(T=300 K)進行了1000ps的分子動力學計算，模擬步長為1 ps，每隔500fs收集1個分子構象保存到結果文件中，選定能量最低的構象為最終的建模結果。

1.3 模型驗證

利用在線軟件PROCHECK驗證立體化學性質的合理性;利用ERRAT(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)評估模型的構建精煉程度;利用Profile_3D對模建結構中氨基酸序列的相容性進行初步評價打分。

1.4 分子對接

丙二酸單酰輔酶A(Compound ID:10663;MF:C24H38N7O19P3S)和對-香豆酰輔酶A(Compound ID:5280329;MF:C30H42N7O18P3S)的結構來源于NCBI Pubchem(http://Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫，并進行三維結構轉化備用。

利用Molegro Virtual Docker(MVD)(http//:www.molegro.com/products.php)軟件的Detect Cavities模塊尋找配體結合口袋。在相同的對接條件下，利用MVD的Docking Wizard將配體(對-香豆酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A)與決明CHS進行對接。根據構象聚類分析的結果，選取最低能量構象作為最終結合構象，生成決明CHS與配體的復合物結構，并進行能量最小化(EM)和動力學模擬(MD)，用于底物結合位點和催化機制的分析。

2 結果和討論

2.1 序列比對和同源模建

PDB數據庫搜索結果表明，苜蓿CHS的氨基酸序列與決明CHS的氨基酸序列同源性最高，一致性(Identity)為88%，相似性(Positives)為95%，因此選擇苜蓿CHS晶體(PDB編號:1CHW_B)作為同源建模的模板。對決明CHS進行二級結構預測并與苜蓿CHS進行序列比對(圖1)，預測結果表明決明CHS中有13個α螺旋，占32.82%，15個β折疊，占19.23%，無規則卷曲占47.95%。將決明CHS與苜蓿CHS序列提交到自動建模服務器SWISS-MODEL，獲得了決明CHS的初始模型。初始模型與模板疊合后的root-mean-square deviation(RMSD)值為0.105?，表明決明CHS的三維結構與苜蓿CHS的三維結構十分相似(圖2)。

圖1 決明CHS與苜蓿CHS的序列比對Fig.1 Sequence alignment of Chalcone synthase from S.tora and M.sativa using proteins aligning module of DS，the secondary structure was demonstrated with“α”for α-helices，“β”for β-sheets and“c”for random coils

圖2 模型決明CHS與模板苜蓿CHS的三維結構疊合Fig.2 3D superimposition structure of Chalcone synthase from S.tora and M.sativa，the yellow ribbon represented the model and the red one represented the template

2.2 同源模型的驗證

利用PROCHECK分析優化后模型的立體化學合理性，模型的主鏈和側鏈立體化學構型均較為合理，并且從Ramachandran圖(圖3)中可見該模型的主鏈結構合理:蛋白的φ、ψ二面角90.6%在核心區域，9.1%在允許區域，絕大多數φ-ψ角均在正常范圍內，沒有落在不允許區域內的殘基。用ERRAT對模型進行評估，得到其綜合質量因子為93.684，表面模型的精煉程度符合分析要求。用Profile-3D對模建結構中氨基酸序列的相容性進行評價(圖4)，結果顯示大約95.64%的殘基的得分均大于0.2，表面該模型的側鏈環境是合理的。以上分析結果表明，決明CHS的三維結構模型能夠用于對接研究。

圖3 決明CHS建模結構的Ramachandran plotFig.3 Ramachandran plot of the modeled structure of Chalcone synthase from S.tora

2.3 對接研究與活性位點

為了進一步確定模型的穩定性，分別將決明CHS，決明CHS-丙二酰輔酶A復合物和決明CHS-(對-香豆酰輔酶A)復合物進行動力學模擬，計算得到模擬過程中所有構象與初始構象的RMSD值。如圖5所示，在100 ps的平衡模擬的軌跡中，決明CHS-丙二酰輔酶A復合物和CHS-(對-香豆酰輔酶A)復合物的RMSD值(0.442?與0.472?)均低于決明CHS的RMSD值(0.852?)。該結果表明當CHS-配體復合物形成后，由于配體與酶分子間存在大量的氫鍵和范德華力，使得CHS的三維結構更趨于穩定。

圖4 決明CHS建模結構的Profile-3D圖Fig.4 Profile-3D score of the modeled structure of Chalcone synthase from S.tora

圖5 動力學模擬過程中所有構象與初始構象的均方根偏差值(RMSD)Fig.5 The root-mean-square deviations(RMSD)calculated for backbone atoms of ligands-bound complex and for backbone atoms of SMT without ligands during MD simulations

與苜蓿CHS類似，決明CHS的三維結構中含有兩個重要的結構域:對-香豆酰輔酶A結合域與丙二酰輔酶A結合域［3］。對-香豆酰輔酶A結合域主要由 133Ser、164Cys、193Ile、194Thr、197Thr、210Val、254Ile、263Leu、265Phe、269Lys、305Gly、338 Ser 和374Gly等殘基構成。對-香豆酰輔酶A與決明CHS對接后，其 MolDockScore為-188.745，結合自由能為-242.575KJ/mol。對-香豆酰輔酶 A結合域中133Ser、164 Cys、194Thr、197Thr、269Lys、305Gly、338 Ser與374Gly等殘基與對-香豆酰輔酶A形成氫鍵，剩余的殘基(193Ile、210Val、254Ile、263Leu、265Phe)與對-香豆酰輔酶A通過范德華力相互作用，從而穩固對-香豆酰輔酶A在復合物的空間位置(圖6)。對-香豆酰輔酶A分子中的泛硫醇部分伸入到CHS酶中，從而定位了最后的已連接硫酯的底物結合于殘基Cys 164(催化殘基)上。Cys 164的巰基硫原子與對-香豆酰輔酶A分子中香豆?；踉有纬蓺滏I，距離為 3.412 ?。

圖6 對-香豆酰輔酶A與決明查爾酮合酶的結合位點Fig.6 Binding sites of p-coumaroyl-CoA with Chalcone synthase from S.tora

丙二酰輔酶 A結合域主要由 Lys55、Met59、Lys62、Ser133、Cys164、Thr197、Leu206、Asp207、Val210、Phe215、Ile254、Phe265、Val271、Gly305、Gly306和Ala308等殘基構成。丙二酰輔酶A與決明CHS對接后，其 MolDockScore為-180.226，結合自由能為-220.396 KJ/mol。丙二酰輔酶A結合域中Met59、Ser133、Asp207與Gly305等殘基與丙二酰輔酶 A形成氫鍵，剩余的殘基(Lys55、Lys62、Cys164、Thr197、Leu206、Val210、Phe215、Ile254、Phe265、Val271、Gly306、Ala308)與丙二酰輔酶 A 通過范德華力相互作用，從而穩固丙二酰輔酶A在復合物的空間位置(圖7)。

圖7 丙二酰輔酶A與決明查爾酮合酶的結合位點Fig.7 Binding sites of malonyl-CoA with Chalcone synthase from S.tora

2.5 催化機制的推測

如上所示，底物與查爾酮合酶特異性結合的立體化學特征闡明了 Cys164、Phe215、Phe265、His303、Asn336在反應機制中的作用［5］。Phe215和Phe265主要負責底物丙二酸單酰輔酶A結合的特定方向，從而控制聚酮中間物的延伸。Cys164的巰基氫原子與 His303咪唑環上的 N原子相距3.493 ?，Cys164、His303與活性中心的H2O能夠形成電子傳遞體系。首先，水分子轉移1個電子至His303的咪唑環上，然后該電子再轉移至Cys164的巰基上使后者為負電子基團。隨后該負電子基團進攻對-香豆酰輔酶A的香豆酰基，形成1分子CHS-對-香豆?；闹虚g產物，而輔酶A從CHS中分離出來［3］(圖8)。

圖8 對-香豆酰輔酶A與決明CHS結合產生單烯酮中間產物的假設機制Fig.8 Hypothetical mechanism for p-coumaroyl-CoA binding with CHS from S.tora with the generation of a monoketide intermediate

3 結論

查爾酮合成酶(CHS)是植物中類黃酮生物合成途徑的關鍵酶，是調控植物類黃酮物質合成的關鍵基因之一，對植物具有非常重要的意義。迄今為止未有CHS與對-香豆酰CoA復合物的結晶結構報道，使得人們無法進一步認識CHS與對-香豆酰輔酶A的結合與催化機制。因此，本研究利用同源建模的方法構建決明CHS的三維模型，PROCHECK與Profile-3D檢驗發現模型中幾乎所有氨基酸殘基的二面角與側鏈環境均處于合理區，表明所建模型可信度高，能夠用于后續的對接研究。通過分子對接，篩選到若干與底物(對-香豆酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A)結合的關鍵氨基酸殘基，它們主要通過氫鍵、范德華力與底物結合，從而穩定底物在酶分子中的空間位置。根據CHS的酶學特性與對接結果，推測決明CHS中Cys164、His303與活性中心的H2O能夠形成電子傳遞體系，參與酶促反應過程。以上研究成果能夠為利用此類CHS三維模型研究其催化機理和分子工程改造奠定基礎。

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3 Ferrer JL，Jez JM，Bowman ME，et al.Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis.Nat Struc Biol，1999，6:775-784.

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5 Liao H(廖海)，Zhou JY(周嘉裕).Molecular cloning and analysis of a Chalone synthase gene of Cassia tora.Acta Botan Boreali-Occidentalia Sin(西北植物學報)，2008，28:1728-1733.