鏈霉菌3704殺蟲成分及對小菜蛾的毒力測定

沈會芳，張廣文，林壁潤*，蒲小明

1廣東省農業科學院植物保護研究所廣東省植保新技術重點實驗室，廣州 510640;2暨南大學藥學院，廣州 510632

殺蟲抗生素是一類由微生物產生的具有殺蟲活性的次級代謝產物，具有高效、專化和對環境安全等特點。從20世紀50年代，開始對殺蟲抗生素進行研究，其中阿維菌素是開發最成功的品種［1］，自投放市場以來，成為繼Bt制劑、井岡霉素之后的生物農藥產業又一支柱產品。我國農用抗生素研究起步于20世紀80年代，相繼研發出一批新品種，如浙江農科院的殺蚜素、上海農藥研究所的瀏陽霉素、上海農科院植保所的韶關霉素［2］、江西農業大學的南昌霉素和梅嶺霉素等［3］。但害蟲具有多樣性，且對現有的農藥品種不斷產生抗藥性，這要求不斷開發新農用抗生素以滿足農業生產需要。

本課題組在東南亞及中國內地采集土壤樣品，分離鏈霉菌近3000株，以蔬菜重要害蟲小菜蛾(Plutella xylostella)為靶標篩選殺蟲抗生素，獲得殺蟲素3704，該活性物質對小菜蛾、蚜蟲和水產害蟲錨頭蚤有較好的殺蟲效果。本文報道了殺蟲素3704對小菜蛾的生物活性，并對該活性物質進行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈霉菌3704(Streptomyces sp.)分離自烏魯木齊伊寧那抗提的沿河樹林，在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No:M206067。

小菜蛾(P.xylostella)于室內人工飼料繼代培養。

培養基:生長培養基:高氏一號瓊脂;發酵培養基:葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、豆餅粉1.5%、玉米漿 1.5%、NaCl 0.5%、CaCO30.3%、pH 7.0 ～7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 殺蟲素3704粗提物的制備

將鏈霉菌3704斜面成熟孢子制成孢子懸浮液，接入發酵培養基中進行液體發酵培養，接種量為10%，發酵溫度30℃，轉速150 rpm，發酵培養96 h后，離心，保留菌絲體，用60%的丙酮浸泡12 h，離心后，保留浸泡液。用大孔樹脂對浸泡液進行吸附后，丙酮洗脫，然后減壓濃縮，得到棕色油狀物，為殺蟲素3704的粗提物。

1.2.2 殺蟲素3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性

將殺蟲素3704粗提物用丙酮配制不同濃度的溶液，把菜心葉片浸泡于溶液中30 min，取出，自然晾干，將30頭2齡小菜蛾幼蟲接到處理后的菜心葉片上，每處理3個重復，在28℃條件下養殖，每24 h調查死亡蟲數，計算藥劑LC50及其回歸方程。殺蟲素粗提物溶液濃度分別為 1.75、3、17.5、30、175 和350 μg/mL，對照用純丙酮溶液處理。

1.2.3 殺蟲素3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治試驗

挖取大小較一致約有5片葉的菜心植株，移栽于花盆中，每盆3棵。移栽7d后，每盆接50頭以上大小較一致的2齡小菜蛾幼蟲，24 h后，檢查植株上蟲量，若有逃逸則補足50頭，用手持噴霧器對葉片正反面及莖均勻噴施藥液。殺蟲素3704粗提物濃度分別為500、250和125 μg/mL，阿維菌素濃度為8 μg/mL，每處理設3個重復，另設置清水對照。施藥后48、72、96 h調查植株上的活蟲量，計算蟲口減退率和防治效果。

1.2.4 殺蟲素3704活性組分的分離純化及結構鑒定

將3704粗提物加水混合均勻后，分別用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取各三次，利用其殺蟲活性跟蹤有效物質，經真空液相層析(VLC)，以石油醚/乙酸乙酯溶劑體系梯度洗脫，共得到9個組分。經活性檢測，其中主要組分3704-1具有殺蟲活性，將其進一步進行純化，獲得純品，進行化學結構鑒定。

2 結果與分析

2.1 殺蟲素3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性

從表1可見，殺蟲素3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性為 24 h時 LC50為 59.82842 μg/mL，48 h 為 38.66165 μg/mL，72 h 為 22.69325 μg/mL。可見隨著處理時間的延長，對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性的LC50越來越小，72 h的LC50比24 h的LC50降低近2.2倍，表明隨著處理時間的延長，殺蟲素3704對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性越高。

表1 3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的生物活性Table 1 Insecticidal activities of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella

2.2 殺蟲素3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治試驗

從表2可知，施藥后48 h，3704粗提物的500 μg/mL劑量對小菜蛾2齡幼蟲的防治效果與阿維菌素的8 μg/mL劑量的同期防效相當，當施藥時間延長到72和96 h后，500 μg/mL的3704粗提物的防治效果則稍低于8 μg/mL的阿維菌素的同期防效。

表2 3704粗提物對小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治效果(%)Table 2 The control efficacy of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella in pots

2.3 殺蟲活性成分結構鑒定

殺蟲活性成分3704-1為無色片狀結晶，活性成分m.p.111～113 ℃。由 ESI-MS m/z 387［M+Na］+得知分子量為364，結合13C NMR譜顯示有28個碳、DEPT譜顯示有6個甲基，1個亞甲基和5個次甲基，元素分析表明化合物3704-1中含有硫、氮和氯，并根據偶氮規則，分子中應含有兩個N原子，可確定化合物3704-1分子式C19H25ClN2OS，不飽和度為 8。經1H NMR譜、13C NMR譜、1H-1H COSY譜、HMBC譜、DEPT譜和HSQC譜等綜合分析，與已有化合物進行比對，鏈霉菌3704產生的殺蟲活性成分為已知物Pyridaben，中文名噠螨酮，系統名為2-叔丁基-5-(4-叔丁基芐硫基)-4-氯-3(2H)-噠嗪酮(圖1)。

圖1 化合物3704-1的結構式Fig.1 Chemical structures of compound 3704-1

Pyridaben是日本日產化學工業公司1984年發現的噠嗪酮類化合物，1991年商品化，對植食性害螨整個生長期和粉虱、蚜蟲、薊馬等均有效。對益蟲安全，對哺乳動物毒性低，LD50(鼠)820～135 mg/kg，在環境中的持效期短，DT50為20 d。目前，該品種在我國已有較多企業生產并廣泛應用，是我國殺螨劑的主要品種之一。

3 結論

本研究以小菜蛾為靶標篩選出鏈霉菌3704，3704粗提物對農業重要害蟲小菜蛾有較好的殺蟲活性，隨著處理時間的延長，對小菜蛾2齡幼蟲殺蟲活性的LC50越來越小，表明其殺蟲活性越高。盆栽防治試驗發現，施藥48 h，3704粗提物500 μg/mL劑量對小菜蛾2齡幼蟲的防治效果與8 μg/mL劑量的阿維菌素相當，但隨著處理時間的延長到72和96 h，其防治則稍低于阿維菌素。

3704殺蟲活性物質化學結構經鑒定為已有并商品化的殺螨劑Pyridaben，Pyridaben自發現以來一直以化學方法進行合成生產，本研究首次從微生物次級代謝產物中分離出該活性物質。Pyridaben屬噠嗪酮類化合物，該類化合物通過在輔酶Q位點上與復合物I鍵合來抑制線粒體的電子傳遞鏈，從而高效阻止線粒體的分離的復合物I氧化作用，達到殺死蟲體的效果［4］。本研究發現Pyridaben對小菜蛾也有較好的殺蟲效果。

1 Mrozik H，Eskola P，Linn BO.Discovery of novel avermectins with unprecedented insecticidal activity.Experientia，1989，45:315-316.

2 Liu X(劉旭)，Liu HL(劉虹伶)，Xia XQ(夏先全).A progress and development foresight of antibiotic insecticides.Southwest China J Agric Sci(西南農業學報)，2007，20:1283-1286.

3 Sun YH(孫宇輝)，Zhou XF(周秀芬)，Tu GQ(涂國全)，et al.Overview and prospect on the study of secondary metabolites and metabolic engineering of Streptomyces nanchangensis.Chin Bull Life Sci(生命科學)，2005，17:207-210.

4 Yuan JZ(袁建忠)，Tang ZH(唐振華).Acaricide and its reacting mechanism.World Pest(世界農藥)，2005，27(6):1-5.