CXCR4 shRNA對膠質瘤U251細胞 Bcl-2和Bax表達及凋亡的影響

劉長琦 (第一汽車集團公司總醫院，吉林 長春 130011)

神經膠質瘤是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，約占顱內腫瘤的32.26% ～60.96%〔1〕，即使采用多種治療手段，包括手術、放療和化療，預后仍極差，死亡率很高〔2〕。近年來，以惡性腫瘤相關基因為靶點的基因治療倍受研究者的青睞。CXCR4是組織表達最為廣泛的細胞因子受體之一，在乳腺癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、神經母細胞瘤、膠質瘤和腦膜瘤等至少20種腫瘤細胞中表達〔3〕，并且其表達水平隨著病理級別的增高而升高。本文在構建、篩選有效的CXCR4 shRNA的基礎上，將其轉染膠質瘤細胞株U251，觀察其對U251細胞Bcl-2和Bax表達及細胞凋亡的影響，探討CXCR4對膠質瘤細胞特征影響的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 膠質瘤U251細胞株(吉林大學第二臨床醫院保存)，Lipofectamine2000轉染試劑盒及Trizol試劑購于Invitrogen公司;RT-PCR二步法試劑盒購自Fermentas公司;CXCR4-shRNA載體pGPU6/GFP/Rac1-421由本室構建、篩選。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 冷凍保存于液氮中的U251細胞復蘇后，接種于含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養液中常規培養。取對數生長期的U251細胞以1×106個/孔接種于無菌6孔板，待細胞培養至80%時進行實驗。實驗分為轉染CXCR4-shRNA載體的 pGPU6/GFP/Rac1-421組、轉染非特異的 PGPU6/GFP/NC組和未轉染組，按照Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒說明書轉染。

1.2.2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 轉染shRNA 48 h后，各組細胞胰酶消化，預冷PBS洗滌2次后重懸收集細胞，加入－20℃ 的85%乙醇，4℃固定過夜。PBS洗滌，加PI染液，避光，置于室溫30 min后上機，檢測細胞凋亡。

1.2.3 RT-PCR檢測各組細胞Bcl-2和Bax mRNA表達 轉染24 h后取各組細胞，按Trizol試劑盒抽提總RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，在PCR儀上進行擴增反應。PCR引物由上海英駿生物科技有限公司提供。Bcl-2引物:5'-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3';5'-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3'，擴增片段大小304 bp;Bax引物:5'-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3';5'-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3'，擴增片段209 bp，以GAPDH基因為內參引物:5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3';5'-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGT-3'，擴增片段471 bp。PCR擴增后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用圖像掃描儀拍照并進行條帶灰度分析，以目的條帶與內參條帶灰度比值表示mRNA相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS12.0軟件進行分析，數據以±s表示，行t檢驗。

2 結果

2.1 CXCR4 shRNA對U251細胞凋亡的作用 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，pGPU6/GFP/Rac1-421組、pGPU6/GFP/NC組和未轉染組凋亡率分別為(8.42±2.82)%、(5.27±0.85)%、(3.99±1.31)%;pGPU6/GFP/Rac1-421組凋亡率最高(P＜0.05);pGPU6/GFP/NC組和未轉染組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 CXCR4 shRNA對U251細胞Bcl-2和Bax mRNA表達的影響 1.5%凝膠電泳顯示三組細胞PCR產物，條帶與目的擴增產物長度一致(圖1)，用Quantity One圖像分析軟件分析，pGPU6/GFP/Rac1-421組的U251細胞Bcl-2 mRNA顯著低于相對于pGPU6/GFP/NC組和未轉染組(P＜0.05)，pGPU6/GFP/NC組和未轉染組間差異無統計學意義(P＞0.05)。pGPU6/GFP/Rac1-421組的U251細胞Bax mRNA顯著高于pGPU6/GFP/NC組和未轉染組(P＜0.05)，pGPU6/GFP/NC組和未轉染組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 RT-PCR檢測各組U251細胞中Bcl-2和Bax mRNA的表達

表1 各組細胞Bcl-2及Bax mRNA表達的變化(±s)

表1 各組細胞Bcl-2及Bax mRNA表達的變化(±s)

與pGPU6/GFP/NC組和未轉染組比較:1)P＜0.05

1 081.27±79.49 1 336.56±159.96 pGPU6/GFP/NC組 978.60±97.50 1 541.33±165.51 pGPU6/GFP/Rac1-421組 580.78±89.901) 2 066.62±123.37*Bcl-2 Bax未轉染組組別

3 討論

膠質瘤是神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，惡性程度高，預后很差，而且腦膠質瘤對化療藥物往往不敏感或者耐藥，因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。siRNA技術是近年發展的一項新技術，可以完全下調特定蛋白的表達能力，對特定基因產生基因抑制作用，已成為當前腫瘤治療研究的一個重要手段〔4〕。

CXCR4/SDF-1軸與多種腫瘤細胞的惡性表現密切相關，不僅在腫瘤細胞的生長、轉移中起著重要的作用，而且與腫瘤細胞的增殖和分化密切相關。劉佳鑫等〔5〕認為膠質瘤可能利用SDF-1與CXCR4的結合使癌細胞侵入正常組織形成轉移腫瘤，這無疑為膠質瘤研究開辟了一個新的天地。

正常情況下細胞增殖與凋亡保持著動態平衡，而惡性腫瘤細胞表現的增生異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉移中發揮重要作用。因此通過調控靶基因促進腫瘤細胞的凋亡，從而抑制細胞的增殖是腫瘤基因治療的一個機制。研究表明CXCR4的特異性siRNA能夠誘導Jurkat細胞凋亡和細胞周期阻滯〔6〕，抗 CXCR4 單克隆抗體促進胃癌、乳腺癌細胞凋亡〔7，8〕。本研究結果證實CXCR4 shRNA可誘導U251細胞發生凋亡，并且明顯增加其凋亡率。提示CXCR4 shRNA可通過促進腫瘤細胞的凋亡而抑制瘤細胞的增殖。

Bcl-2與Bax是野生型p53的下游基因，是目前研究較為深入的凋亡調控基因。Bcl-2為凋亡抑制基因，其活性增高，可抑制細胞凋亡，延長細胞生命〔9〕，而Bax與Bcl-2蛋白質有一定的相似性。Bax是一種促凋亡基因〔10〕，抑制細胞增殖。因此，同時檢測Bcl-2和Bax更能全面反映它們對細胞凋亡的調控作用。本研究結果表明凋亡相關基因 Bcl-2與 Bax在CXCR4 shRNA促進U251細胞凋亡過程中發揮非常重要的作用。綜上研究，CXCR4 shRNA可通過調控Bcl-2與Bax的表達水平，促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖，CXCR4有望成為膠質瘤基因治療中的新靶位。

1 王忠誠.神經外科學〔M〕.第5版.武漢:湖北科學技術出版社，2005:512.

2 Wen PY，Kesari S.Malignant gliomas in adults〔J〕.N Engl J Med，2008;359(5):492-507.

3 Duda DG，Kozin SV，Kirkpatrick ND，et al.CXCL12(SDF1alpha)-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition:an emerging sensitizer for anticancer therapies〔J〕.Clin Cancer Res，2011;17(8):2074-80.

4 De Clercq E.Potential clinical applications of the CXCR4 antagonist bicyclam AMD3100〔J〕.Mini Rev Med Chem，2005;5(9):805-24.

5 劉佳鑫，王崇謙，王偉民，等.SDF-I/CXCR4在惡性膠質瘤細胞體外增殖、遷移及侵襲中的作用〔J〕.昆明醫科大學學報，2013;1:23-7.

6 王 艷，劉曉日，譚艷芳，等.RNA干擾沉默CXCR4基因對Jurkat細胞周期和凋亡的影響〔J〕.中國實驗血液學雜志，2010;3:625-8.

7 羅 君，吳小翎.抗CXCR4單克隆抗體對胃癌細胞增殖與凋亡的影響〔J〕四川醫學，2008;29(2):137-40.

8 馬大昌，武 力，王育成，等.CXCR4單克隆抗體對人乳腺癌細胞MCF-7凋亡的影響〔J〕.現代腫瘤醫學，2006;14(11):1383-6.

9 Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis〔J〕.Mol Cell Biochem，2011;351(1-2):41-58.

10 Westphal D，Dewson G，Czabotar PE，et al.Molecular biology of Bax and Bak activation and action〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1813(4):521-31.