流式細胞儀在檢測系膜細胞衰老特征中的應用

田 曉 史國輝 孫淑豐 孟曉華 馮曉明 徐湜潺 孫 原 董 科 王玉潯

(河北聯合大學附屬醫院腎內科，河北 唐山 063000)

流式細胞儀是采用流式細胞技術對細胞或顆粒懸液進行快速分析的自動化分析儀器。流式細胞術(FCM)通過對流動液體中排成單列的細胞或顆粒進行逐個分析、測定細胞或顆粒的光散射和熒光情況，以獲得其大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特征。這種分析儀器綜合了光學、電子學、流體力學、細胞化學以及激光和計算機等多門學科和技術，具有檢測速度快、測量指標多、采集數據量大、對所需的細胞或顆粒可以進行分選等特點，在細胞生物學、分子生物學、腫瘤學、血液學、免疫學、遺傳學等方面得到了廣泛的應用。本文正是根據FCM的特點，將其應用到檢測系膜細胞衰老的特征中，驗證其可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 3月齡健康雄性Wistar大鼠〔河北聯合大學實驗動物中心提供，SCXK(京)2010-0013〕10只。RPMI 1640細胞培養粉劑及Trypsin(h1∶250)購于美國GIBCO公司。胎牛血清購于美國 Hyclone公司。5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)購于美國Program公司。碘化吡啶(PI)及RNA酶購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠系膜細胞培養 無菌條件下取雙側腎臟，剝離腎包膜，用剪刀把腎皮質剪成碎塊，放于重疊的3層不銹鋼篩網上研磨，鏡下觀察，若見98%以上的腎小球脫去包曼囊，視野中基本上無腎小管存在，即可停止沖洗，收集第2層篩網上的組織移入離心管，V型膠原酶消化后，應用15%胎牛血清的RPMI1640培養液，37℃、5%CO2條件下培養原代的系膜細胞，約7 d后第1次傳代，傳代的細胞24 h全部貼壁，生長迅速，形態為梭形或不規則星形，3～4 d已匯合成片，純度極高，經鑒定結蛋白(Desmin)陽性、抗Ⅷ因子抗體陰性，傳代，用于實驗的為第3、5、10 代。

1.2.2 衰老相關β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色 種于六孔板中的各組細胞，待細胞生長至80%匯合，用PBS液清洗3次，于室溫固定細胞5 min，PBS液清洗3次后，加上新配制的含1 mg/ml X-gal的 SA-β-gal染液，置 37℃(無 CO2)溫育12～16 h，PBS液清洗3次后，觀察細胞胞質中藍色沉淀，用數碼相機照相。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞自發熒光、細胞周期及細胞大小細胞培養至70% ～80%融合時，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集離心管中。取1×106個細胞，75%乙醇4℃固定過夜(可于4℃存放1 w備用)。測定前離心除去75%乙醇，用PBS洗2次，重懸于0.5 ml PBS中。應用Becton-Dickinson流式細胞儀(激發光波長488 nm，發射光波長570 nm)檢測自發熒光。然后樣品經50 μg/ml RNA酶處理后，用PI 50 μg/ml于暗處染色30 min后上機。應用流式細胞分析儀的FACScan測量DNA含量，以前向角散射光(FSC)的平均強度來反映細胞的大小，細胞周期變化數據用Cell FIT Cell Cycle Analysis Version 2.18.2軟件分析;以細胞周期各時相細胞百分率記錄數據并分析;細胞增殖指數(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.3 統計學方法 使用SPSS11.0軟件，計量資料使用±s表示，組間差異比較采用單因素方差。

2 結果

2.1 大鼠原代系膜細胞增殖能力 3月齡大鼠的原代系膜細胞為長梭形或不規則星形，貼壁后生長迅速，約3～4 d后可傳第1代，可傳10代以上。但在傳代過程中，系膜細胞逐漸衰老，細胞肥大，形態變扁平、伸展，排列稀疏，代謝減慢、生長停滯，失去增殖和傳代能力。實驗用細胞為第3、5、10代。

2.2 細胞SA-β-gal染色結果 細胞衰老時均伴隨著β-半乳糖苷酶活性增高，因此SA-β-gal染色是目前國際公認的細胞復制性衰老的特征性指標〔1〕。本研究結果顯示:第3代系膜細胞染色陽性率很低，僅為(8.6±2.5)%，而隨增齡，系膜細胞βgal染色陽性率也逐漸增高，第5代為(27.0±3.9)%，而第10代細胞陽性率高達(76.9±9.6)%，3組間兩兩相比，差異有統計學意義(均為P＜0.05)，表明大鼠原代系膜細胞隨傳代次數的增長而發生衰老。

2.3 自發熒光的檢測 第3、5、10代自發熒光強度分別系膜細胞傳代過程中，自發熒光逐漸增強(P＜0.05)。見圖1。

2.4 不同代次系膜細胞的細胞大小 流式細胞儀檢測的結果顯示，第3代系膜細胞FSC熒光強度最弱，隨著傳代次數的增加，FSC熒光強度顯著增加，即細胞體積明顯增大。見圖2。

2.5 不同代次系膜細胞的周期分析 原代細胞生長旺盛，細胞增殖加速，處于S期的細胞明顯多于傳代中的各代細胞。系膜細胞在傳代過程中生長逐漸減慢，細胞從G1期進入S期的比例逐漸降低。傳代末期，細胞生長趨于停滯，死亡細胞增加(表1)。

圖1 流式細胞術檢測各代細胞自發熒光

圖2 流式細胞術檢測FSC熒光強度

表1 不同代次系膜細胞的周期分析(%，n=3，±s)

表1 不同代次系膜細胞的周期分析(%，n=3，±s)

與第3代比較:1)P＜0.05;與第5代比較:2)P＜0.05

PI第3代 72.14±3.34 14.79±2.15 11.86±1.38 26.97±1.98組別 細胞周期G0/G1 S G2/M第5代 81.52±2.96 9.40±1.61 9.06±0.58 18.16±2.641)第10代 91.02±4.25 5.76±3.54 3.18±2.10 8.94±2.581)2)

3 討論

隨著年齡的增長和細胞的老化，系膜細胞功能的下降與異常，與許多衰老相關腎臟疾病的發生、發展有著極為密切的關系〔2〕。本實驗證實系膜細胞在傳代過程中，細胞形態發生著明顯的變化。SA-β-gal是公認的細胞老化的生物標志。在各種類型體內或體外的老化細胞，該酶的活性增強。本實驗結果顯示，在傳代過程中，細胞形態與功能發生著明顯的變化，細胞逐漸走向衰老。系膜細胞的自發熒光逐步增強。細胞傳代末期，細胞的自發熒光現象達到頂點。目前認為，細胞自發熒光現象與細胞內脂褐素的形成與積聚有關〔3〕。脂褐素的堆積促進老年色素斑的出現，導致細胞分化能力降低，是細胞衰老的表現之一。研究人員發現脂褐素含量高的細胞在外界有害因素的作用下，較正常細胞更易出現損傷〔4〕。脂褐素與體內氧自由基生成，導致溶酶體、線粒體等細胞器中的銅發生脂質過氧化有關。過度加劇的脂質過氧化反應產生過量的脂褐素，從而出現脂褐素沉著。脂褐素沉積在細胞中，導致細胞代謝減緩、活性下降、細胞損傷等細胞老化的表現。在高傳代細胞，細胞的自發熒光產物顯著增加，自發熒光強度增強，說明脂褐素的積累達頂峰。可見，在衰老的過程中，細胞內脂質過氧化增強，并可能與氧自由基合成增加有關。

細胞肥大是衰老細胞的最基本標志及形態特征〔5～8〕。本實驗結果顯示，隨著傳代次數的增加，FSC熒光強度顯著增加，即細胞體積明顯增大，細胞逐漸衰老。

細胞周期狀態反映了細胞的增殖能力。增殖旺盛的細胞處于S期的比例較高〔9〕。細胞衰老時，細胞增殖能力降低，細胞生長停滯。本結果說明在不斷傳代時，由于細胞衰老，功能下降，DNA錯配率增加，攝取各種物質的能力降低，隨之而來的是增殖減緩。

綜上所述，隨著系膜細胞不斷的傳代，細胞形態退化，SA-β-gal活性增強，體積增大，細胞增殖能力降低，顯示細胞有明顯的復制性衰老特征〔10～12〕。在系膜細胞衰老的過程中，細胞內脂質過氧化作用增強，導致自發熒光產物增加。而流式細胞儀能很好的檢測到這些改變，因此它是一種檢測細胞衰老指標的良好方法，可以廣泛應用到細胞衰老的研究中。

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