血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ADAMTS5、ADAMTS4及MMP-9表達(dá)的影響

李 蕾 陳黎明 趙傳艷 崔連群 (山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管形成促進(jìn)劑之一。已有報(bào)道用于缺血性心臟病的治療〔1～3〕。刺激VEGF分泌的主要因素有缺血、缺氧、炎癥因子等，最主要的因素之一是缺血、缺氧〔4〕。VEGF與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)之間可能有相互促進(jìn)作用。含iv型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 (ADAMTS)與MMPS同屬于金屬蛋白酶家族，其中ADAMTS4、ADAMTS5均能降解蛋白聚蛋白多糖。目前尚無(wú)VEGF對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞MMPs及ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M冠心病缺血缺氧狀態(tài)下VEGF分泌增加，且與缺血缺氧嚴(yán)重程度分泌相一致，觀察VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9及ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)及活性的影響，探討VEGF和MMP-9、ADAMTS-5、ADAMTS4的作用及其與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定之間的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，rhVEGF165(PEPROTECH公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、血清、胰酶(Hyclone公司)，RNAiso Plus(TaKaRa)，RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)，SYBR GreenI RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)，RIPA 裂解液(強(qiáng))(碧云天)，PMSF(碧云天)，4倍蛋白上樣緩沖液(Solarbio)，PVDF 膜，ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9單克隆抗體(R＆D SYSTEM)，GAPDH一抗(杭州賢至科技)，抗鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 (北京中杉)，BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)。

1.2 儀器 美國(guó)Specltramax酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，DM4000B光學(xué)顯微鏡，QwinV3圖像分析軟件(德國(guó)Leica公司)，日本Image Reader LAS-4000凝膠成像儀，Multi gaugeV3.2圖像分析軟件，美國(guó)Bio-Rad PCR儀，Light Cycler 480Ⅱ PCR儀。

1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，90%1640培養(yǎng)基，青鏈霉素終濃度100 U/ml)恒溫溫箱37℃孵育培養(yǎng)3 d，傳代后，待細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)力旺盛、狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換用0.5%胎牛血清(BSA)的培養(yǎng)基同時(shí)加入 rhVEGF165，使其終濃度為0，10，20，50 ng/ml，恒溫孵育培養(yǎng)24 h，分別提取總RNA及細(xì)胞總蛋白。

1.4 Real Time-PCR 上述細(xì)胞每107個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞用1 ml RNAiso Plus抽提細(xì)胞總RNA，并用分光光度計(jì)測(cè)量其濃度，用A260/A280值在1.8～2.0確定其純度，取500 ng總RNA作為模板，照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成第一鏈cDNA，取稀釋3倍后的 cDNA 5 μl為模板，加入 ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9、β-ac-tin上下游引物各1 μl及10 μl SYBR Green熒光定量PCR體系，95℃ 5 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 1 min，45 個(gè)循環(huán);并進(jìn)行溶解曲線測(cè)試。應(yīng)用Light Cycler 480Ⅱ 系統(tǒng)擴(kuò)增，結(jié)果采用2－ΔΔct分 析。ADAMTS-5，上 游 5'-TCGTAGGTCTGTCCTGGGAGTTC-3'，下 游 5'-AATGCACTTCAGCCACCATCA-3';ADAMTS-4上游5'-GACACGCTGGGTATGGCTGA-3'，下游5'-ACTGATGCATGGCTTGGAGTTG-3';MMP-9上游5'-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3'，下游 5'-CCAAACTGGATGACGATGTC-3';β-actin上游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下游5'-CTA AGTCAT AGT CCG CCT AGA-AGCA-3'。

1.5 Western印跡 提取上述細(xì)胞總蛋白，測(cè)濃度后蛋白變性，取蛋白50 μg加入4倍蛋白上樣緩沖液總體積約10 μl上樣，以5%濃縮膠、10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，70 V，30 min，預(yù)電泳，30 V，60 min，一階段電泳，100 V，70 min 二階段電泳，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部后，100 V，90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%牛奶封閉1 h，加入 AMAMTS5(1∶250)一抗、ADAMTS4(1∶200)一抗、MMP9(1∶200)、β-Actin(1∶800)一抗 4℃搖床上孵育過(guò)夜，PBST洗膜 10 min×3，加 HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG(1∶10 000)，室溫?fù)u床上孵育 1 h，PBST 洗膜 10 min ×3，Image Reader LAS 4 000顯影儀上進(jìn)行發(fā)光顯影，并進(jìn)行分析，測(cè)定各蛋白平均光密度值，并求得各蛋白帶與β-actin比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS17.0，數(shù)據(jù)用±s表示，不同組間比較采用one way-ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達(dá)變化 不同處理組間，隨著 rhVEGF165 刺激濃度 0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達(dá)逐步升高(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達(dá)水平

2.2 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化 不同處理組間，隨著 rhVEGF165 刺激濃度0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各濃度rhVEGF-65刺激后ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9 轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊肩部及脂質(zhì)核心處，MMP-9活性增高，其通過(guò)降解纖維帽中的膠原和基質(zhì)，使纖維帽逐漸變薄，斑塊易損性增加〔5〕。ADAMTS4、ADAMTS5結(jié)構(gòu)及蛋白水解作用類似于 MMPs〔6～9〕，最近有研究證實(shí) ADAMTS4在外周血抗原水平隨著冠心病嚴(yán)重程度逐漸加重，且與冠狀動(dòng)脈復(fù)雜病變的數(shù)量存在正相關(guān)，活性可被TIMP3阻斷，同時(shí)表明ADAMTS4通過(guò)降解蛋白多糖verican/aggrecan導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，并闡明了ADAMTS-4在急性冠脈綜合征中的診斷價(jià)值及其誘導(dǎo)斑塊不穩(wěn)定的機(jī)制〔10〕。

VEGF除了能高效的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，抑制多種因素導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使內(nèi)皮細(xì)胞快速修復(fù)，并能間接抑制血管平滑肌的增殖遷移〔11〕。本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了 VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞 MMP-9、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達(dá)及蛋白合成，促進(jìn)其活性增強(qiáng)。其機(jī)制可能為:①隨著粥樣硬化進(jìn)展，內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，機(jī)體缺血缺氧而產(chǎn)生的VEGF，通過(guò)多種復(fù)雜機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶，如纖溶酶、纖溶酶原激活物、MMPs、ADAMTS等，使基質(zhì)蛋白被酶水解，導(dǎo)致斑塊易損性增強(qiáng);②導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定并加速其進(jìn)展的另一主要機(jī)制是斑塊內(nèi)出血，VEGF刺激引起小的、易損血管在進(jìn)展期斑塊內(nèi)形成，導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血，引起急性癥狀。上述三種蛋白酶作用均可被TIMP3抑制，提示利用TIMP-3生物活性劑阻斷ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的一條新途徑。

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