氨基葡萄糖對體外培養人骨關節炎滑膜細胞中炎性細胞因子表達的影響

楊建輝 呂建國 聶會勇 申曉東 (西安交通大學第一醫院疼痛科，陜西 西安 710061)

骨關節炎(OA)的發生機制主要是抗炎因子與促炎因子失衡導致的關節軟骨破壞和滑膜炎癥反應。白細胞介素(IL)-18是近年來人們發現的一種新的致炎細胞因子，其主要生物學功能為介導組織炎癥反應，且與一些自身免疫性疾病相關〔1，2〕。氨基葡萄糖不僅可以減輕OA疼痛癥狀，同時可以延緩OA的病理改變，為改變病情藥物〔3〕。本實驗通過觀察氨基葡萄糖對體外培養人骨關節炎滑膜細胞中白細胞介素(IL)-18、白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性細胞因子表達的影響，探討氨基葡萄糖防治OA的作用機制，為氨基葡萄糖在臨床上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞取材與藥品 收集2010年6月至2011年3月在我院行膝關節置換術或關節鏡檢查OA患者滑膜組織30例，所有患者均符合1986年美國風濕病學會關于OA的臨床診斷標準或臨床及放射學診斷標準，隨機抽取5例用于實驗，并簽署患者知情同意書。氨基葡萄糖(伊索佳，浙江海正藥業生產)。

1.2 主要試劑及器材 D-Hanks液、含10%胎牛血清DMEM培養液(Gibco)，0.25%胰蛋白酶(Sigma)，25 cm培養瓶，EP管，離心管，倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2細胞培養箱，超凈工作臺，IL-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Uscnlife Science＆Technology Company，武漢中美科技有限公司進口組裝)，TNF-α、IL-1β 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國ADL公司生產，天津瀚洋生物有限公司組裝)。

1.3 滑膜細胞體外培養 主要采用的是滑膜細胞的組織塊培養法〔4〕。用尖刀片仔細分離滑膜組織，將收集來的滑膜組織放入有磷酸鹽緩沖液(PBS)的無菌瓶內，在超凈臺內棄去PBS，用D-Hanks液漂洗滑膜組織3次，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm的小塊，少量培養液濕潤瓶底，將滑膜組織塊以間距5 mm左右放入瓶內，將培養瓶放置入培養箱內，待4 h后組織塊貼牢。再緩慢加入3 ml培養液覆蓋組織小塊。培養3 d后更換培養液，除去未貼壁的組織塊，每瓶中加入4 ml新鮮培養液。以后隔天換液，倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態，待組織塊周圍細胞鋪滿50%培養瓶底面，置胰蛋白酶溶液37℃孵育，達氏修正依氏培養基終止消化，按1∶2比例進行傳代培養接種，3 d換液1次，約10 d左右可長滿瓶底，此為一代滑膜細胞。待布滿培養瓶底面90%面積時，即可按1∶3比例再次進行傳代培養。用抗vimentin抗體作免疫組織化學染色、鑒定。

1.4 含藥血清和正常兔血清的制備 將氨基葡萄糖按體表面積折算動物的等效劑量〔5〕，再用生理鹽水配成8 ml溶液給新西蘭大白兔灌胃，正常兔血清則以生理鹽水8 ml灌胃。連續2次灌胃，中間間隔2 h，在末次灌胃的3 h后，乙醚和氯胺酮復合麻醉下腹主動脈采血，4℃冰箱過液后，離心2 500 r/min×25 min，抽取血清，56℃、30 min 滅活，經 0.45 μm 濾膜抽濾除菌、分裝，－20℃保存備用。

1.5 加藥培養及上清液收集 第一代滑膜細胞轉入12孔的組織細胞培養板，每孔細胞數為1.5×105/L，培養48 h后，用達氏修正依氏培養液清洗2次，吸棄孔中培養液，進行試驗分組。實驗分為4組:A組(對照組)每孔加入正常兔血清200 μl;B組10%含氨基葡萄糖血清200 μl;C組20%含氨基葡萄糖血清200 μl;D組40%含氨基葡萄糖血清200 μl。每組設4個復孔，連續培養48 h，用胰蛋白酶消化細胞并繼續培養1 d后收集培養液上清，編號，－80℃保存待測，滑膜細胞作免疫化學染色。實驗重復5次。

1.6 ELISA檢測 將－80℃保存的細胞培養上清液放于冰盒完全解凍后，按ELISA檢測試劑盒說明操作:加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100 μl，注意不要有氣泡。輕輕混勻，酶標板加上蓋。37℃反應120 min，棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液 A 工作液 100 μl，37℃，60 min。洗板 3 次，350 μl每孔，甩干。每孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃，60 min，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色30 min(此時肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔梯度不明顯)。依序每孔加終止溶液50 μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。

1.7 細胞免疫化學染色 免疫組織化學染色采用SABC法，染色方法及免疫組織化學反應陽性顆粒的平均灰度值測定按文獻〔6〕進行。具體方法簡述如下:將對照組和各加藥組培養的滑膜細胞，以1×104/ml接種在放有預處理蓋玻片的6孔培養板中進行細胞爬片，貼壁培養，待細胞爬片良好長成單層時，移除孔內的液體。PBS(pH 7.2～7.6)液沖洗3次，每次2 min。防止沖洗掉貼壁的細胞。4%多聚甲醛固定，37℃，30 min。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。分別滴加適當稀釋(稀釋度1∶200)的一抗(兔抗人 IL-18、IL-1β和TNF-α抗體)，37℃ 2 h。PBS(pH 7.2～7.6)洗 2 min×3 次。滴加生物素化小鼠抗兔 IgG(二抗)，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次。滴加 SABC-AP，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次。顯色:用TBS(pH 9.0～9.5)按照1∶20的比例稀釋，混勻后加至蓋玻片上，37℃顯色20 min。蒸餾水洗滌。干燥后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.8 免疫組織化學圖像分析 將滑膜免疫組織化學玻片置Olympus顯微鏡下(40×)，對所測視野進行準確定位后由攝像系統提取數值化細胞圖像輸入HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(同濟千屏影像公司)進行處理，每組隨機選取8個不重疊的視野進行處理，測定免疫組織化學反應陽性顆粒的平均灰度值，灰度值越小，表明免疫組織化學反應越強，反之則表達越弱。

2 結果

2.1 培養細胞的觀察、鑒定 培養細胞相差顯微鏡下觀察:組織塊原代培養3 d后，細胞從滑膜組織塊邊緣逸出，7～10 d后，可見大量的細胞從滑膜組織塊邊緣逸出，呈長梭狀極像排列。大部分為成纖維細胞樣細胞，也有部分樹突樣細胞和巨噬細胞樣細胞。14～21 d形成密集的單層細胞瓶壁，部分區域呈堆積樣或漩渦狀生長。細胞長滿培養瓶壁后進行傳代培養時，成纖維細胞樣細胞在0.25%的胰蛋白酶作用下較易于脫離瓶壁;樹突樣細胞和巨噬細胞樣細胞則難以消化，而留于母瓶中，從而獲得較單純的成纖維細胞樣細胞。經過2～3次傳代后培養的細胞，大部分為成纖維細胞樣細胞，經免疫組織化學鑒定可達95%以上。

2.2 ELISA法檢測各組滑膜細胞培養上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量 A組分別與B組、C組、D組IL-18、IL-1β、TNF-α的含量比較差異有統計學意義(P＜0.01)，B組與C組、B組與D組、C組與D組IL-18含量比較差異有統計學意義(P＜0.05)。隨氨基葡萄糖濃度的增加，IL-18含量逐漸降低(D組＜C組＜B組＜A組)。見表1。

表1 各組滑膜細胞培養上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量(pg/ml，±s，n=5)

表1 各組滑膜細胞培養上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量(pg/ml，±s，n=5)

與A組比較:1)P＜0.01;與B組比較:2)P＜0.05;與C組比較:3)P＜0.05

組別 IL-18 IL-1β TNF-α A組69.9±5.2 96.9±5.2 86.1±6.2 B組 38.4±3.51) 45.9±5.21) 43.9±2.21)C組 23.4±1.51)2) 25.6±3.21)2) 27.2±3.21)2)D組 11.4±1.51)2)3) 12.9±5.21)2)3) 11.2±1.21)2)3)

2.3 各組滑膜細胞IL-18與IL-1β、TNF-α的相關關系分析采用 Pearson相關分析，A、B、C、D 組 IL-1β、TNF-α 含量與 IL-18含量呈正相關(r=0.786，P＜0.01)。

2.4 免疫組織化學分析 IL-18、IL-1β、TNF-α陽性結果為滑膜細胞胞質內出現棕黃色深染粒，免疫組化陰性對照僅見滑膜細胞陽性背景著色。B組、C組、D組與A組的IL-18、IL-1β、TNF-α表達率的圖像分析即陽性細胞灰度值結果見表2，IL-18、IL-1β、TNF-α在A組表達率較高，于B組、C組、D組表達率相對較低，并隨著氨基葡萄糖濃度的增加表達率逐漸降低(A組＞B組＞C組＞D組)(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組IL-18、IL-1β、TNF-α表達的免疫組織化學灰度值(±s，n=5)

表2 各組IL-18、IL-1β、TNF-α表達的免疫組織化學灰度值(±s，n=5)

與A組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與 B組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;與C組比較:5)P＜0.05

組別 IL-18 IL-lβ TNF-α A組103±13 112±16 109±15 B組 143±122) 146±112) 135±112)C組 173±121)4) 179±141)4) 172±131)4)D組 212±153)5) 221±123)5) 211±113)5)

3 討論

OA中關節軟骨在致病因素作用下被破壞后，釋放碎片進入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎，滑膜炎釋放炎性介質，進一步降解軟骨，周而復始造成惡性循環，故滑膜炎癥的存在是OA軟骨損傷及OA慢性持續化的重要原因〔7〕。Smith等〔8〕在羊 OA模型中也證實有明顯的滑膜炎病變。并有直接證據表明，滑膜炎的嚴重程度與OA的X線片分級呈明顯的相關性〔9〕。減輕滑膜炎癥的藥物可顯著改善關節的活動度，這些都表明滑膜炎是OA病情進展的重要環節。

IL-18的主要生物學功能為介導組織炎癥反應，且與一些自身免疫性疾病相關〔10〕。Gracie等〔11〕在 OA的滑液和滑膜中測到的IL-18含量比健康人高，而且IL-18表達水平與關節炎活動期密切相關，并通過體外單獨培養非OA患者及OA患者滑膜細胞，對細胞培養上清液進行IL-18檢測，證實了IL-18不僅在在OA患者滑液和滑膜組織中含量較高，在OA患者病變滑膜細胞中亦存在高表達，Joosten等〔12〕通過對關節炎滑膜組織中IL-18水平表達的研究表明，OA關節滑膜滑液中的IL-18通過直接接觸T淋巴細胞，使單核細胞產生的IL-1β和TNF-α增加，其表達與IL-1、TNF-α、局部滑膜的炎癥程度有密切正相關關系，能提高和擴增兩者水平，且與疾病急性階段相平行，表明IL-18是關節炎中最初的一種重要的細胞因子。既往的研究表明炎性細胞因子IL-1β、TNF-α在OA的發生發展中發揮著重要作用，而IL-1β、TNF-α則是存在于OA軟骨和滑液中的重要炎性細胞因子，能抑制軟骨細胞增殖和代謝，誘導軟骨細胞去分化，促進軟骨基質降解〔13〕。

氨基葡萄糖是治療OA的特異性藥物，有研究顯示氨基葡萄糖除能夠刺激軟骨細胞產生蛋白多糖，參與透明質酸和多聚氨基葡萄糖的合成外，同時具有抑制肉芽組織增生、血管滲出和細胞游離，有效改善關節炎的癥狀〔14〕。本文與Joosten等〔12〕的研究相一致，這說明IL-18是關節炎中最初的一種重要的始動細胞因子，氨基葡萄糖能夠下調IL-18、IL-1β、TNF-α在OA滑膜細胞中的表達，減輕滑膜炎癥，從而抑制軟骨降解，達到治療膝OA的目的。體外培養可以排除體內病變時全身免疫系統及內分泌系統可能對IL-18、IL-1β、TNF-α分泌造成的影響，能更直接地反映在OA病變中IL-18、IL-1β、TNF-α參與了滑膜細胞炎癥反應的過程。

1 Brisdelli F，D'Andrea G，Bozzi A.Resveratrol:A natural polyphenol with multiple chemopreventive pro-perties〔J〕.Curr Drug Metab，2009;10(6):530-46.

2 Fabris S，Momo F，Ravagnan G，et al.Antioxidant properties of resveratrol and piceid on lipid peroxidation in micelles and monolamellar liposomes〔J〕.Biophys Chem，2008;135(1-3):7683.

3 皮俊杰，呂志偉，閆志榮，等.前交叉韌帶切斷誘導兔膝骨關節炎模型:阿侖磷酸鈉與鹽酸氨基葡萄糖對其關節軟骨和軟骨下骨的保護作用〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;14(28):5151-4.

4 包樂媛，李會強，畢曉陽，等.人滑膜細胞的分離培養與鑒定〔J〕.中國醫學檢驗雜志，2004;5(2):386-8.

5 詹紅生，趙詠芳，馮 偉.含藥血清方法在中藥調節骨與軟骨代謝基礎研究中的應用〔J〕.中國骨傷，2000;13(11):661-2.

6 司徒鎮強，吳軍正.細胞培養〔M〕.西安:世界圖書出版西安公司，2004:21-3.

7 Haynes MK，Hume JB.Phenotypic characterization of inflammatory cells from osteoarthritic synovium and synovial fluids〔J〕.Clin Immunol，2002;105(23):315.

8 Smith MM，Cake MA，Ghosh P，et al.Significant Synorial pathology in a meniscectomy model of osteo-arthritis:modification by intra-articular hyaluronan therapy〔J〕.Rheumatology(Oxford)，2008;47(12):1172-8.

9 Krasnokutsky S，Attur M，Palmer G，et al.Current concepts in the pathogenesis of osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2008;16(Suppl 3):1-3.

10 Ushio S，Namba M，Okura T，et al.Cloning of the CDNA for human IFN-gamma-inducing factor，expression in Escherichia coli，and studies on the biologic activities of the protein〔J〕.Immunology，1996;156(25):4274.

11 Gracie JA，Foresy RL，Chan WJ，et al.A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis.Clin Invest，1999;104:1393-401.

12 Joosten L，Radstake TR，Lubberts E，et al.Association of interleukin-18 expression with enhance levels of both interleukin-1 beta and tumor necrosis factor alpha in knee synocial tissue of patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Rheum，2003;48(15):339-47.

13 Fernandes JC，Martel-Pelletier J，Pelletier JP.The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology〔J〕.Biorheology，2002;39(17):237-46.

14 張偉斌，莊澄宇，李健明，等.鹽酸氨基葡萄糖治療骨性關節炎有效性與安全性評價〔J〕.中華外科雜志，2007;45(14):998-1001.