CAV1基因在五種白血病細胞中的表達

馬 微 李 麗 楊永旭 葛堂棟 樸金花 張鵬霞

(牡丹江醫(yī)學院研究生處，黑龍江 牡丹江 157011)

細胞癌變的本質(zhì)是信號轉(zhuǎn)導通路失調(diào)導致的細胞無限增殖〔1〕。伊馬替尼等藥物對慢性粒細胞性白血病(CML)治療獲得的成功證明了靶向治療白血病是重要的發(fā)展方向〔2，3〕。Caveolin-1(CAV1)是caveolae的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于信號通路交聯(lián)中心，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CAV1基因的突變?nèi)笔А幼訁^(qū)域CpG島位點的高密度甲基化〔4〕、CAV1-α亞型中Y14磷酸化的異常〔5〕、上游轉(zhuǎn)錄因子及信號蛋白的異常啟動激活CAV1或上調(diào)其表達量均可引起腫瘤的發(fā)生。本實驗選取具有代表性的五種白血病細胞株，從基因、蛋白水平檢測CAV1的表達，探討CAV1在白血病中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Reverse Transcriptase M-MLV、SYBR Premix Ex Taq購于 TaKaRa公司，Trizol試劑購于 Invitrogen公司，M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent試劑盒、蛋白定量試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit、化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒購于Pierce公司，聚氟偏乙烯(PVDF)膜購于MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與收集 SUP-B15、HL-60、THP-1、K562白血病細胞為本實驗室保存，人慢性淋巴細胞白血病原代腫瘤細胞采用磁珠分選分離收集，人正常白細胞(WBC)由本實驗室常規(guī)分離收集。

SUP-B15、HL-60、THP-1、K562 細胞常規(guī)懸浮培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d傳代1次。1 000 r/min離心收集細胞沉淀。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的制備 離心收集洗滌細胞1×107個，加入1 ml Trizol試劑，反復吹打后12 000 r/min，4℃離心5 min，將上清移至經(jīng)DEPC水處理過的1.5 ml無菌離心管中進行總RNA的抽提。紫外分光光度計測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應體系為 RNA/引物變性液10 μl，5×M-MLV 緩沖液4 μl，dNTP Mixture 1 μl，Ribonuclease Inhibitor 1 μl，RTase MMLV 1 μl，RNase free dH2O 加至 20 μl，42℃保溫 1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。

1.2.3 細胞總蛋白提取 使用M-PER人蛋白抽提試劑盒，每2×107個細胞加入1 ml M-PER試劑，反復吹打至液體黏稠，4℃ 1 000 r/min離心5 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整濃度至10 μl，－20℃保存。

1.2.4 CAV1 mRNA表達水平的熒光實時定量PCR(QRTPCR)檢測 引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列見表1。PCR反應條件為95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環(huán)數(shù)為40。擴增體系為Takara SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上下游引物各 0.4 μl，cDNA 模板2 μl，加水至總體積為 20 μl。采用用△△Ct方法，以看家基因β-actin mRNA作為對照，通過Ct值進行數(shù)據(jù)分析。因在細胞中擴增曲線良好，呈明顯“S”型，反應體系擴增率正常。引物溶解曲線峰型單一，引物特異性良好，PCR產(chǎn)物單一。與WBC對照細胞(0.781±0.16)相比，SUP-B15(0.311±0.07)、HL-60(0.097 ± 0.02)、K562(0.127 ± 0.04)、THP-1(0.101±0.02)、CLL細胞(0.100±0.02)CAVI mRNA表達均降低。

2.3 CAV1蛋白表達水平的Western印跡檢測結(jié)果 與對照組相比，在選取的五種白血病細胞中CAV1蛋白表達量均降低，且表達量由低到高依次為 CLL、HL-60、THP-1、K562、SUPB15。見圖2。

表1 引物序列

1.2.5 CAV1蛋白表達水平的Western印跡檢測 將蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰酶(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗2遍，加入CAV1 一抗(1∶500)或 β-actin一抗(1∶800)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入二抗抗兔(1∶4 000)或抗鼠(1∶6 000)孵育，洗膜、發(fā)光、曝光、顯影、定影，采用灰度掃描軟件TotallLab進行膠片灰度掃描，分析檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料采用t檢驗或單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA濃度及純度檢測結(jié)果 紫外分光光度計結(jié)果顯示A260/280在1.8～2.0之間，總RNA無明顯基因組DNA污染，無明顯降解。100 V恒壓下1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，電泳結(jié)果顯示，28 S和18 S rRNA兩條帶較為清晰，RNA純度較高，無明顯降解。見圖1。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 CAV1 mRNA表達水平的QRT-PCR檢測結(jié)果 CAV1基

圖2 Western印跡檢測CAV1蛋白表達水平

3 討論

CAV1在腫瘤中的生物學作用是復雜的，可影響腫瘤的多藥耐藥〔4～6〕;調(diào)節(jié)細胞周期〔7〕與信號轉(zhuǎn)導;參與調(diào)控衰老過程〔8，9〕;可增強細胞自噬功能〔10，11〕;參與細胞增殖、轉(zhuǎn)移等。CAV1基因在腫瘤中的作用存在著爭議，抑癌基因還是癌基因不可一概而論，在不同的腫瘤細胞中充當著不同的角色。在白血病細胞中，CVA1因類型不同表達亦不相同。有研究顯示HTLV-1感染的T細胞株與未感染的T細胞株和正常的外周血單個核細胞相比，這些細胞表現(xiàn)出了CAV1的高表達〔12〕。急性白血病患者中初治時CVA-1蛋白表達水平明顯低于正常對照組，誘導化療緩解后表達水平有所上升，復發(fā)時表達水平再次下降，且可作為療效判斷指標〔13〕。國內(nèi)外對CAV1基因與白血病發(fā)生機制的研究報道尚且不多，本課題為深入研究CAV1在白血病中的作用提供了必要的前提，具有重要的意義。

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