鹽酸椒苯酮胺致突變實驗

陳陽述 李茹冰 李 健 吳新榮 孫智平 陳 新 萬華印

(解放軍第四五八醫院全軍肝病中心，廣東 廣州 510602)

鹽酸椒苯酮胺(PPTA)為我國原始創新的心血管化學藥，是鈣增敏劑類強心藥及心肌保護劑〔1〕。臨床前研究發現，其具有良好的保護受損心肌、增強心功能并降低心肌耗氧量的雙重作用;可增加心肌收縮蛋白對Ca2+的敏感性，而不增加心肌細胞內Ca2+濃度，甚至有抗Ca2+超載作用，無致心律失常的危險〔2，3〕;可通過開放血管平滑肌細胞鈣敏感鉀離子通道產生舒張血管作用;藥物代謝快，不會在體內積蓄〔4〕。目前國內外尚無同類藥物，已獲得SFDA頒發的1.1類化學藥品臨床試驗批件。為評價其安全性，需了解它有否致突變作用，課題組依據中國藥典2005年版二部及新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編(藥學、藥理學、毒理學)的有關技術要求，進行了鹽酸椒苯酮胺Ames試驗、小鼠微核試驗及中國倉鼠肺細胞染色體畸變試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥與動物 鹽酸椒苯酮胺:中國醫學科學院藥物研究所藥物化學室合成，批號88102，純度 (99±0.5%)。陽性對照品 2，7，-2-氨基芴(2，7-2AF)，2-氨基芴(2-AF)，9-芴酮，甲基甲烷磺酸酯(MMS)，正定霉素(DMC)，Vp16，環磷酰胺(CP)，上海第十二制藥廠生產;卡鉑(Carboplatin)，山東齊魯藥廠生產;均為化學純。試驗菌株:組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏桿菌TA97、TA98、TA100和TA102系中國醫學科學院藥物研究所保存菌種，經檢定符合要求后凍存于-80℃冰箱。代謝活化劑自行制備。

1.1.2 實驗動物 雄性昆明種小鼠，體重22～25 g，中國醫學科學院實驗動物所。中國倉鼠肺細胞(CHL)，中國醫學科學院藥物研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 回復突變試驗(Ames試驗) 參照鼠傷寒沙門氏桿菌/哺乳動物微粒體酶致突變試驗方法，對鹽酸椒苯酮胺進行非代謝活化和代謝活化的平板參入檢測。從液氮罐中取出菌種，37℃ 水浴融化后接種到營養肉湯中，37℃ 恒溫振蕩培養12 h。試驗藥物鹽酸椒苯酮胺共設7個劑量組，分別為 0.1、1、5、10、20、100、1 000 μg/皿。另設空白對照組和陽性對照組。非活化系統(加0.5 ml PBS)和活化系統(加0.5 ml S9混合液)并加入0.1 ml不同濃度的菌液及0.1 ml不同濃度的鹽酸椒苯酮胺，混勻后倒入平板鋪平。每個劑量2皿。各種菌的陽性對照組加相應的陽性誘變劑。將所有培養皿倒置于(37±1)℃培養箱中孵育48 h，計數每皿回變菌落數。以回變菌落數超過對照組2倍以上視為Ames陽性。

1.2.2 鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓細胞微核試驗 預試驗:以鹽酸椒苯酮胺58.5 mg/kg，按0.2 ml/10 g體重靜脈注射。分別在給藥后18、24、30、48及72 h后處死3只小鼠，取股骨骨髓制片，Giemsa染色，計數1 000個嗜多染紅細胞數和含微核的嗜多染紅細胞數，以千分率表示。結果顯示，對照組與各采樣點的微核率無顯著差異，故正式實驗時采用給藥后24 h取骨髓制片。

正式試驗:將30只小鼠按體重隨機分成5組，每組6只。設鹽酸椒苯酮胺3個劑量組，分別為58.5、29.0、14.5 mg/kg;另設正常對照組及陽性對照組(環磷酰胺50 mg/kg腹腔注射1次)。藥物均用15%丙二醇配制，以0.2 ml/10 g體重尾靜脈注射。給藥后24 h處死小鼠，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色。觀察計數1 000個嗜多染紅細胞含有微核細胞數(MNPCE)。

1.2.3 哺乳動物細胞染色體畸變試驗 預試驗:50%細胞生長抑制試驗:每個培養瓶接種6×104個細胞，培養24 h后，加入5個不同濃度的鹽酸椒苯酮胺，培養48 h，換以新鮮培養液繼續培養9 d后棄液。甲醇冰醋酸固定，Giemsa染色，計數每瓶集落數，然后以藥物濃度的對數為橫坐標，細胞生長率為縱坐標作圖，求得鹽酸椒苯酮胺抑制細胞生長50%的濃度為8.0 μg/ml，以它作為正式實驗的最高濃度。

正式試驗:實驗設3個劑量組，終濃度分別為鹽酸椒苯酮胺8、2、0.5 μg/ml，另設陽性對照組及陰性對照組。活化系統中所含0.5 ml S9混和液于作用6 h后去除，換新培養甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定3次，制片，空氣干燥，Giemsa染色10 min。每組觀察計數100個中期細胞分裂相，觀察并記錄染色體數目和結構情況畸變。

2 結果

2.1 鹽酸椒苯酮胺的Ames試驗 見表1。從表中可以看出不論加與不加S9混合物，各陽性誘變劑回變菌落數均超過空白對照組2倍;鹽酸椒苯酮胺每皿濃度為100和1 000 μg時，對4菌株均有抑菌毒性，其余各劑量組均在正常范圍內波動，故判定鹽酸椒苯酮胺的Ames試驗結果為陰性。

表1 鹽酸椒苯酮胺Ames試驗結果(±s，n=2)回變菌落數/皿

表1 鹽酸椒苯酮胺Ames試驗結果(±s，n=2)回變菌落數/皿

藥物(μg/皿) TA 97TA 98TA 100TA 102－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9 216±6 242±5 27±0 38±6 143±0 157±10 353±10 578±20 0.1 205±1 218±10 22±6 38±6 137±20 177±13 336±23 387±15 1 215±2 242±10 21±0 36±2 171±7 178±8 353±13 539±5 5 150±5 203±7 16±1 22±4 218±0 189±1 139±5 362±8 10 182±14 232±2 － 42±6 134±9 193±13 75±19 407±0 20 123±8 16±1 110±0 165±3 － 359±1 100 1 000 9-芴酮 0.2 983±10 2，7-2AF 20 509±20 2AF 10 1 736±509 1 360±40 DMC 20 1 440±0 MMS 2.0 μl 6 740±370 1 606±48 PPTA 0 Vp16 1.0 mg 1 270±37

2.2 鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓細胞微核試驗 見表2。從表中可以看出環磷酰胺陽性組與對照組相比較，微核率顯著增高(P＜0.001)，而各給藥組的微核率分別與對照組相比較，無顯著性差異(P＞0.05)。說明鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓微核試驗結果為陰性。

2.3 鹽酸椒苯酮胺對CHL細胞染色體試驗 結果見表3。從表中看出，陽性藥組與對照組比較，畸變率明顯升高，具有極顯著差異(P＜0.001)。而鹽酸椒苯酮胺各劑量組對CHL細胞染色體的畸變率與對照組相似，均在正常范圍。表明鹽酸椒苯酮胺對CHL細胞染色體的畸變率在正常范圍內，故試驗結果為陰性。

表2 鹽酸椒苯酮胺的微核試驗結果(±s)

表2 鹽酸椒苯酮胺的微核試驗結果(±s)

藥物 n 微核率(‰) P/N P值6 1.66±0.67 40/60鹽酸椒苯酮胺14.5 mg/kg 6 1.17±0.31 36/64 ＞0.05 29.0 mg/kg 6 0.83±0.31 42/58 ＞0.05 58.5 mg/kg 6 1.00±0.37 35/65 ＞0.05環磷酰胺15%丙二醇50.0 mg/kg 6 38.20±3.00 30/70 ＜0.001

表3 鹽酸椒苯酮胺的染色體畸變試驗結果

3 討論

PPTA是中國自主研發的鈣增敏劑類強心藥及心肌保護劑，具有完全自主知識產權，藥物物質及其合成工藝、適應證、中間體合成工藝、制劑及單晶等5個發明專利均獲授權〔5～7〕。目前已完成Ⅰ期臨床試驗，結果顯示該藥的人體耐受性良好、臨床藥代動力學特征與臨床前實驗一致。鹽酸椒苯酮胺Ames試驗通過檢測鼠傷寒沙門氏菌回變菌落數，來推斷鹽酸椒苯酮胺是否存在引起基因突變的遺傳毒性;小鼠微核試驗通過靜脈給予小鼠鹽酸椒苯酮胺后，觀察小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的變化，從而來推斷受試物的致突變性;中國倉鼠肺細胞染色體畸變通過觀察中國倉鼠肺細胞染色體形態、結構及數量是否改變來推斷鹽酸椒苯酮胺是否存在有引起染色體畸變的遺傳毒性。3項試驗均陰性說明鹽酸椒苯酮胺無致突變作用。

1 楊向陽，李若冰，萬華印.新型鈣增敏劑左西孟旦和鹽酸椒苯酮胺研究進展〔J〕.國際藥學研究雜志，2010;37(1):32-5.

2 萬華印.心血管化學創新藥鹽酸椒苯酮胺(PPTA)〔EB/OL〕.(2004206230)〔2009208201〕.

3 李茹冰，萬華印，鄧鳳君，等.心血管創新藥鹽酸椒苯酮胺//中國藥理學會藥學監護專業委員會第一屆第四次學術研討會論文摘要匯編〔C〕.北京:中國藥理學會，2008:44.

4 牟 英，孟志云，竇桂芳.椒苯酮胺在比格犬體內的藥代動力學研究〔J〕.中國血液流變學雜志，2006;16(3):338-40.

5 萬華印，李茹冰，周力踐.椒苯酮胺、椒苯酮胺鹽及其制備方法:中國，ZL 02125318.8〔P〕.2004209201.

6 萬華印，李茹冰，周力踐.椒苯酮胺或其鹽用作制備治療心血管疾病藥物的應用:中國，ZL02125316.1〔P〕.2005206215.

7 萬華印，李茹冰，周力踐.N-甲基胡椒乙胺鹽的制備方法:中國，ZL 02125317.X〔P〕.2004209215.