絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)骨代謝指標(biāo)的分析

楊立順，袁海生，沈興婭，康建華，王艾云

(天津市中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300400)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。PMOP是指絕經(jīng)后婦女由于體內(nèi)卵巢功能低下、雌激素水平低落、骨偶聯(lián)過程失調(diào)、破骨細(xì)胞的骨吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成作用所導(dǎo)致的骨量減少，骨脆性增加，進(jìn)而易于發(fā)生骨折的代謝性骨疾病。我們通過觀察調(diào)控破骨細(xì)胞活性的主要因子和骨吸收及骨形成標(biāo)志物在PMOP患者體內(nèi)水平的變化，為臨床早期防治骨質(zhì)疏松提供依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

從2008年2月到2009年4月隨機(jī)從居住于天津市并在天津市北辰中醫(yī)醫(yī)院體檢中心體檢的中老年女性中選出符合納入研究標(biāo)準(zhǔn)的88例絕經(jīng)后女性作為研究對象。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn):漢族，自然絕經(jīng)年限≥1年，年齡 ＜70歲。其中PMOP患者38例，年齡47～69歲;骨量減低者50例，年齡45～68歲。絕經(jīng)后骨量正常婦女94名作為正常對照組，年齡45～66歲。曾感染過骨代謝疾病的個(gè)體在研究中被排除，包括腎、肝、甲狀旁腺、甲狀腺疾病以及糖尿病、高催乳素血癥、卵巢切除、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤、血液疾病，以前有病理性骨折和1年內(nèi)的骨折。另外有下列情況的個(gè)體也被排除:3個(gè)月內(nèi)服用過影響骨代謝藥物如糖皮質(zhì)激素、雌激素、甲狀腺激素、甲狀旁腺激素、氟化物、二磷酸甘油酸、降鈣素、噻嗪類利尿藥、巴比妥酸鹽、免疫抑制劑和維生素D等。

二、骨密度測定

采用美國通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)的Achilles Insight系列超聲骨強(qiáng)度儀對足跟骨進(jìn)行骨強(qiáng)度測定。骨強(qiáng)度指數(shù)測定結(jié)果與診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)——雙能X線吸收骨密度測定法的相關(guān)系數(shù)(r)為0.91，骨強(qiáng)度指數(shù)T-值衰減和骨密度得到的T-值衰減呈線性關(guān)系，強(qiáng)度指數(shù)與雙能X射線吸收測定值有同等的精度。根據(jù)“原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南”:骨強(qiáng)度值低于同性別、同種族健康成人骨峰值的 1s～2.5s(T-值為 －1.0 ～ －2.5)之間的列為骨量低下(骨量減少)組;降低程度≥2.5s(T-值＜－2.5)的列為骨質(zhì)疏松組。

三、樣本采集和測定

1.樣本采集 受試者均于晨7∶00～9∶00抽取空腹靜脈血，分離血清，樣本保存于－20℃冰箱內(nèi)。

2.測定指標(biāo) 血清骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)與核因子-kβ受體活化因子配體(nuclear factor-k beta receptor activator ligand，RANKL)使用奧地利 Biomedica Medizinprodukte GmbH＆Co.KG公司試劑盒，2個(gè)項(xiàng)目批內(nèi)變異系數(shù)(CV)＜10%，批間CV＜10%;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)-5b與骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BAP)使用英國Immunodiagnostic Systems公司試劑盒，2個(gè)項(xiàng)目的批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜10%，平均回收率分別為100.9%、99.6%。以上4項(xiàng)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，使用芬蘭產(chǎn)MK3酶標(biāo)儀及上海思橋測定軟件定量分析。血清同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)采用北京九強(qiáng)生物技術(shù)公司生產(chǎn)的循環(huán)酶法檢測試劑盒，CV＜10%;檢測敏感性為1.5 mmol/L。血清雌二醇(estradiol，E2)檢測采用法國梅里埃 miniVIDAS全自動免疫熒光分析儀，使用原裝試劑，批內(nèi) CV＜7.5%，批間 CV ＜9.5%，檢測敏感性為 5 pg/mL。各項(xiàng)目檢測的操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、PMOP組、骨量減低組和正常對照組血清骨代謝指標(biāo)比較

PMOP組、骨量減低組和正常對照組之間E2、OPG、RANKL、TRACP-5b、BAP、Hcy 水平及 OPG/RANKL比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01、P ＜0.001)。PMOP 組 BAP 水平明顯高于骨量減低組及正常對照組(P＜0.001)，E2水平明顯低于骨量減低組(P＜0.001)及正常對照組(P＜0.05)。骨量減低組與正常對照組之間BAP和E2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組骨代謝指標(biāo)比較()

表1 3組骨代謝指標(biāo)比較()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01、＊＊＊P ＜0.001;與 PMOP 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01、###P ＜0.001

組別 例數(shù) 年齡(歲) TRACP-5b(U/L) BAP(μg/L) Hcy(mmol/L)正常對照組 94 54.19 ±4.91 3.02 ±0.66 12.69 ±4.04 18.03 ±6.92骨量減低組 50 53.22 ±5.90## 3.39 ±0.77＊＊# 13.45 ±5.02### 20.80 ±7.11*#PMOP 組 38 56.85 ±6.21＊＊ 3.64 ±0.78＊＊＊ 17.28 ±6.19＊＊＊ 24.58 ±11.18＊＊＊OPG/RANKL正常對照組組別 例數(shù) E2(pg/mL) OPG(pmol/L) RANKL(pmol/L)94 22.57 ±9.93 3.10 ±0.44 0.33 ±0.07 9.99 ±3.22骨量減低組 50 19.60 ±7.76# 2.75 ±0.36＊＊＊# 0.36 ±0.06*### 7.96 ±2.16＊＊＊#PMOP 組 38 14.41 ±12.66＊＊＊ 2.56 ±0.57＊＊＊ 0.42 ±0.08＊＊＊ 6.51 ±2.02＊＊＊

二、各項(xiàng)指標(biāo)的偏相關(guān)分析

1.控制年齡因素后，E2與 TRACP-5b、BAP呈負(fù)相關(guān)[r值分別為 －0.198(P=0.007)，－0.157(P=0.035)]，與 OPG、RANKL 和 Hcy無相關(guān)性[r值分別為 0.106(P=0.154)、－0.132(P=0.076)、0.030(P=0.69)]。

2.控制年齡、E2 因素后，Hcy與 RANKL、TRACP-5b、BAP 呈正相關(guān)[r值分別為 0.368(P ＜0.001)、0.193(P=0.009)、0.224(P=0.002)]，與 OPG 呈負(fù)相關(guān)(r= －0.330，P ＜0.001)。

3.OPG 與 TRACP-5b呈負(fù)相關(guān)(r= －0.458，P=0.008)，RANKL 與 BAP 呈正相關(guān)(r=0.228、P=0.044)。

三、ROC曲線分析

采用 ROC 曲線評價(jià) E2、Hcy、OPG、RANKL、TRACP-5b、BAP對PMOP的診斷準(zhǔn)確度，見表2、圖1、圖2。TRACP-5b和BAP診斷骨質(zhì)疏松的Cut-off值分別是3.44 U/L 和 17.84 μg/L。

表2 各項(xiàng)目對PMOP的診斷準(zhǔn)確度

圖1 TRACP、BAP、Hcy、RANKL 檢測 ROC 曲線

圖2 E2、OPG檢測ROC曲線

四、PMOP影響因素的Logistic回歸分析

二分類Logistic回歸分析表明，獨(dú)立于年齡，血清 E2、TRACP-5b、OPG、Hcy對骨質(zhì)疏松有顯著影響，OPG、E2為保護(hù)因素，Hcy、TRACP-5b為危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 骨質(zhì)疏松影響因素的Logistic回歸分析

討 論

大量事實(shí)證明[1-3]，雌激素對骨形成有促進(jìn)作用，那么當(dāng)雌激素缺乏時(shí)，就應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)骨形成障礙，然而大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，絕經(jīng)后女性雌激素水平降低時(shí)，骨吸收亢進(jìn)的同時(shí)，骨形成也亢進(jìn)，發(fā)生高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。近年來，發(fā)現(xiàn) OPG/RANKL/核因子-kβ受體活化因子(nuclear factork beta receptor activator，RANK)系統(tǒng)可調(diào)控破骨細(xì)胞的生成及其功能，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松或致骨質(zhì)疏松的作用。

OPG是一種分泌型糖蛋白和缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的TNF受體家族成員。OPG的配基RANKL在骨骼中的主要作用為刺激破骨細(xì)胞的分化和活性，抑制破骨細(xì)胞的凋亡，是成熟破骨細(xì)胞形成的主要刺激因子，而且對其生存很重要，其表達(dá)的增加會導(dǎo)致骨吸收和骨丟失。目前大量研究表明OPG與RANKL在破骨細(xì)胞發(fā)育的終末階段發(fā)揮重要作用，是破骨細(xì)胞分化和維持功能的最終調(diào)節(jié)因子[4]。RANK是破骨細(xì)胞表面介導(dǎo) RANKL生物活性的的唯一受體，而OPG是RANKL的競爭配體，通過競爭性抑制RANKL與RANK的結(jié)合，而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞分化成熟的作用，從而抑制骨吸收。本研究中病例組的血清OPG水平顯著低于正常對照組，表明在絕經(jīng)后婦女中，OPG的減低降低了競爭性抑制RANKL與RANK的結(jié)合，增強(qiáng)了破骨細(xì)胞分化成熟，骨吸收增強(qiáng)，影響了機(jī)體OPG/RANKL系統(tǒng)的偶聯(lián)平衡，進(jìn)而破壞了骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥患者骨吸收大于骨形成，最終導(dǎo)致骨破壞和骨丟失。通過Logistic回歸分析得出，血清OPG對骨質(zhì)疏松有顯著影響，提示血清OPG的增高可能是延緩骨吸收和骨丟失的保護(hù)機(jī)制[5]，對維持絕經(jīng)后的骨量起到重要作用，是骨折的保護(hù)因素。這個(gè)結(jié)果與 Rogers等[6]、Mezquita-Raya 等[7]和梁少俊等[4]的研究相仿。而RANKL則相反，兩病例組均高于正常對照組，證實(shí)了RANKL在骨質(zhì)疏松中刺激破骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞凋亡、增加骨吸收和骨丟失的作用。

雌激素是一種調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的上游因子。有體外試驗(yàn)表明E2能提高OPG mRNA的水平及表達(dá)，明顯提高OPG的水平[8];還能有效地降低體內(nèi)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的水平，間接抑制成骨細(xì)胞分泌RANKL[9]。然而在本研究中雖發(fā)現(xiàn)E2下降的同時(shí)伴有OPG降低、RANKL升高，但并沒發(fā)現(xiàn) OPG、RANKL與血清E2有相關(guān)關(guān)系。這可能與本研究的病例選取、例數(shù)有限有關(guān)。

最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示，Hcy水平增高可能成為骨質(zhì)疏松獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一[10-13]，其機(jī)制主要是通過增加骨吸收，抑制骨形成及膠原蛋白的交聯(lián)而減少骨密度，降低骨質(zhì)量，增加骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組Hcy水平明顯高于正常對照組，并且與血清OPG、RANKL具有相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了Hcy是通過RANKL誘導(dǎo)細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，以及抑制破骨細(xì)胞的程序性凋亡直接增加破骨細(xì)胞的形成，抑制成骨細(xì)胞的活性，減少膠原蛋白交聯(lián)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的。通過Logistic回歸分析，高Hcy是患PMOP的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，深入研究Hcy的致病機(jī)制，通過干預(yù)其影響因素而降低骨質(zhì)疏松癥在絕經(jīng)后婦女、老年人中的發(fā)生率將有重要意義。

骨質(zhì)疏松的早期診斷一直是人們研究的熱點(diǎn)。本研究選擇了骨吸收標(biāo)志物TRACP-5b與骨形成標(biāo)志物BAP進(jìn)行研究。TRACP主要來源于骨吸收過程中破骨細(xì)胞的釋放，來源于破骨細(xì)胞的TRACP-5b具有酶活性[15]。女性絕經(jīng)期后，血清TRACP-5b水平有所升高，如果患有骨質(zhì)疏松，其水平增加更明顯。本研究看到，病例組血清TRACP-5b水平顯著高于正常對照組，診斷骨質(zhì)疏松的ROC曲線下面積為0.731，通過二分類Logistic分析，對骨質(zhì)疏松的影響顯著。因此，骨吸收生化標(biāo)志物TRACP-5b可以作為鑒別快速骨量丟失、診斷骨質(zhì)疏松的可靠指標(biāo)，同時(shí)也是一項(xiàng)較好的抗骨吸收治療的監(jiān)測指標(biāo)。本研究得出TRACP-5b診斷骨質(zhì)疏松的Cut-off值為3.44 U/L。

BAP是成骨細(xì)胞的胞外酶，由于其來源于成骨細(xì)胞，排除肝、腎、腸等疾病影響，故成為反映成骨細(xì)胞活性和骨形成的特異及敏感指標(biāo)，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，則BAP分泌增加[16]。本研究結(jié)果表明，PMOP組BAP水平明顯高于無骨質(zhì)疏松的其他兩組。證實(shí)了PMOP為一種高轉(zhuǎn)換型的骨代謝病，骨吸收與骨形成同時(shí)增強(qiáng)。BAP的檢測對骨代謝疾病骨轉(zhuǎn)換類型的判斷有很好的價(jià)值。本研究得出 BAP診斷骨質(zhì)疏松的 Cut-off值為17.84 μg/L。

綜上所述，血清 E2、OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的重要因素;血清 E2、OPG、Hcy與TRACP-5b是對骨質(zhì)疏松有明顯影響的獨(dú)立因素，可以作為更加準(zhǔn)確的單獨(dú)預(yù)測骨質(zhì)疏松的生化標(biāo)志物。

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