三葉木通葉斑病病原菌鑒定

劉昱鋒， 張 錚，2，3＊， 馬銀峰

（1.陜西師范大學生命科學學院，西安 710062；2.陜西師范大學 藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西安 710062；3.西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，西安 710062）

三葉木通［Akebia trifoliata （Thunb.）Koidz.］為木通科木通屬木質藤本植物，原產于中國和日本，在中國分布于山東、河北、山西、陜西、甘肅及長江流域各省［1］。三葉木通全株均可入藥，2010年版《中華人民共和國藥典》收錄其藤莖作為藥用部分，其具有利尿通淋，清心除煩，通經下乳的功效［2］，現代藥理學證明其所含齊墩果酸具有抗腫瘤活性［3］。

為了適應中藥現代化的要求，我國一些地方已開展了三葉木通的標準化種植。但在陜西的種植地，連續三年發現部分區域三葉木通葉斑病嚴重，葉片大量脫落，嚴重影響藥材的生長。為了明確葉斑病的病原和有效控制葉斑病的發生和蔓延，提高三葉木通藥材質量和產量，本研究對三葉木通人工栽培基地三葉木通葉斑病病原菌進行研究，旨在為三葉木通葉斑病的防治和GAP種植實施提供依據。

目前國內外對于三葉木通病害方面的研究較少。Yoshinori Kobayashi等，根據三葉木通炭疽病病原菌形態特征，將其鑒定為尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatumSimmonds ex Simmonds）［4］。梁志懷等人對湖南省長沙的三葉木通褐斑病進行了研究，根據病原菌孢子形態將其鑒定為鏈格孢屬真菌（Alternariasp.），并進行了室內防治藥劑篩選［5］。而作者的田間調查表明，葉斑病癥狀與以前報道的炭疽病癥狀不同，與褐斑病癥狀與發展進程存在差異。

曾有學者采用傳統的真菌分類方法，從培養特征與孢子形態方面對三葉木通病原菌進行了鑒定。由于真菌形態特征的復雜性與隨環境變化的不穩定性，因此，采用傳統分類法的分析結果易產生意見分歧。rDNA－ITS區受到較低的選擇壓力，物種間ITS區序列表現出較高的差異，其被廣泛應用于物種的鑒定［6］。為了彌補傳統分類方法的不足，本研究采用rDNA－ITS區序列分析結合病原菌的形態特征對陜西三葉木通人工栽培地的三葉木通葉斑病進行較為科學的鑒定。

1 材料和方法

1.1 供試試劑

d NTP Mix和Taq DNA 聚合酶購自 TaKaRa公司，DL2000Marker購自西安潤德生物科技有限公司，通用引物ITS1：5′－TCCGATGGTGAACCTGCGG－3′和ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′由上海生物工程有限公司合成，其他試劑均為國產分析純。

1.2 病害調查與癥狀觀察

根據本實驗室前期研究，三葉木通葉斑病發生期為4－9月。從4月末開始，每30d調查一次，直到9月末停止調查。隨機調查50株，每株分上、中、下共調查30片葉。統計病葉率并按下式計算病情指數，病情指數采用國際通用的9級分級標準［7］。觀察病斑的變化，并記錄各時期的癥狀特點。

1.3 病害樣本采集

從栽培地采集具有典型病斑的三葉木通葉片，裝入滅過菌的牛皮紙袋中，帶回實驗室立即進行病原菌的分離。

1.4 病原菌的分離純化

將采集的具有典型癥狀的三葉木通葉斑病葉片，先在70%的乙醇中消毒10～15s，再置于有效氯含量1%的次氯酸鈉中消毒2min左右，無菌水漂洗3次后，切取病健交界處5mm×5mm的組織塊，置于PDA培養基上，于25℃恒溫培養箱中培養（12h光照／12h黑暗），待菌絲長出后，開始挑取組織塊周圍不同菌絲轉接到新的PDA培養基上培養，通過2～3次連續的轉接純化菌落。對于產孢真菌，采用單孢分離的方法純化；不產孢的真菌，挑取單菌絲片段純化，獲得純的培養物［8］。將純化的真菌4℃下保存，作為待試菌。

1.5 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則，采用離體葉片無傷接種法，對分離的菌物進行接種測定試驗，確定葉斑病的致病菌。接種所用的葉片為健康、無任何斑點的幼葉，流水和無菌水將葉片沖洗干凈，滅菌濾紙吸干葉片上殘留的水分，70%酒精棉擦拭葉片表面。將活化培養5d的純分離物菌絲塊置于葉片上，放入無菌培養皿內，接種葉片下墊無菌水濕潤的無菌濾紙，25℃保濕培養，以放置培養基塊的葉片為對照，每組接種30片葉片，重復3次。

葉片接種菌物后，觀察葉片發病情況，比較接種葉片癥狀與葉斑病原始癥狀，按照上述1.3中方法對發病葉片的致病菌再分離與純化。將分離的病原物的菌落形態、菌落顏色、孢子形態等培養性狀與最初接種分離物進行比較，確認病害的致病菌。

將致病菌活化培養10d，收集孢子，配成106個／mL的孢子懸浮液。分別采用直接懸滴法和針刺懸滴法接種，每葉定點接種5μL孢子懸浮液，放入無菌培養皿內，接種葉片下墊無菌水濕潤的無菌濾紙，25℃保濕培養，以滴加5μL無菌水的葉片為對照，每組接種30片葉，重復3次［9］。

接種后，觀察葉片發病情況，比較接種葉片癥狀與葉斑病原始癥狀，按上述1.3中方法對發病葉片致病菌再分離純化。將分離純化的分離物與接種物進行比較，確認病害的病原菌。

1.6 病原菌的形態觀察

活化病原菌，從菌落邊緣取直徑5mm病原菌絲塊置于PDA培養基上，25℃培養，觀察病原菌在PDA培養基上的菌落形態、大小、產孢情況、色素分泌等性狀。參照張天宇［10］的方法，挑取少許菌體涂布于PCA＋濾紙上，5d后在顯微鏡下觀察分生孢子梗與分生孢子形態，并測量其大小，觀察病原菌的產孢表型，將獲得的數據與《中國真菌志》（第十六卷）中相關種的數據比對。

1.7 病原菌的分子鑒定

1.7.1 病原菌DNA提取

將病原菌轉接到PDA平板上活化培養5d，從菌落邊緣取直徑5mm菌絲塊，接種至PD液體培養基，28℃、150r／min搖床培養3d，收集菌絲，參考楊建雄［11］和張錚［12］提取DNA的方法，在加入 CTAB 提取緩沖液之前，加入洗滌緩沖液（140mmol／L NaCl，200mmol／L Tris－HCl，50mmol／L EDTA，4%β－巰基乙醇），洗去材料中的多糖。其余步驟同CTAB法中的步驟。

1.7.2 病原菌rDNA－ITS區擴增和序列分析

基于前期對病原菌形態的初步研究，初步認為其為鏈格孢屬真菌。根據孫霞［12］等人對鏈格孢屬rDNA－ITS區序列的研究，選取PCR擴增引物：ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，ITS4：5′－CCTCCGCTTATTGATATGC－3′［14］。PCR反應體系：10×Taq buffer 2.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、2.5mmol／L dNTP 2.0μL、10μmol／L正反向引物各2.0μL、20ng／μL DNA模板1μL、5U／μL TaKaRa Taq 0.2μL，補水至總體積25μL。PCR反應條件：94℃3min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，40個循環；72℃10min。4℃保存。PCR反應產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化及測序由上海生物工程有限公司完成。

將病原菌rDNA－ITS區序列與GenBank核酸數據庫中已登錄注冊的rDNA－ITS區序列進行比對，下載同屬及不同屬形態上相似的菌株rDNAITS序列［15］。用ClustalX程序將該菌株與同源性較近的菌株的ITS序列在相應位置對齊，采用Maximum Likelihood法建立系統進化樹。

2 結果

2.1 葉斑病田間發生情況

通過田間調查發現，該病在4月開始出現，但發病率低，病情輕；7月后田間葉片的發病率為100%，6月和7月是該病的快速發展期；8月至9月病情發展變慢（見表1）。

表1 三葉木通葉斑病的發病率與病情指數Table 1 The incidence and disease index of leaf spot of A.trifoliata

2.2 葉斑病病害癥狀

4月三葉木通葉斑病開始發生，4月至5月為初期，葉片病部出現紅褐色針尖狀圓點，隨后圓點逐漸擴大，紅褐色圓點擴大為1～2mm的斑點。6月至7月末為其葉斑病中期，紅褐色圓點逐漸擴展成近圓形或多個病斑相接成不規則形病斑，病斑呈紅褐色或深紅褐色，病健部交界明顯。8月至9月為葉斑病后期，是三葉木通葉斑病嚴重發生的時期，病斑進一步擴大并連成大病斑，病斑呈黑褐色，葉片背面出現霉層（圖1）。發病嚴重的植株，整株葉片布滿病斑，且葉片大量脫落，嚴重影響其光合作用及生長。

圖1 田間病葉不同時期癥狀Fig.1 Symptoms of the diseased leaves at different stages in the field

2.3 病原菌致病性測定

菌絲塊無傷接種幼葉，與對照相比，接種真菌的葉片可以發病。接種36h后，葉片均表現出感病變化。患病葉片表現出的癥狀與田間自然發病癥狀相似。從接種后發病的組織再次分離出該致種真菌，菌落形態、孢子形態與接種真菌一致。

然后，用該真菌孢子懸浮液接種刺傷的幼葉，48h后葉片開始發病，發病率為100%；用該真菌孢子懸浮液接種無傷的幼葉，72h后葉片開始表現出感病變化，發病率為53.3%（圖2）。患病葉片表現出的癥狀與田間自然發病癥狀相似，而對照未發病。從接種后發病的組織再次分離到該致病菌，結果證明該致病菌為葉斑病的病原菌。

圖2 接種后葉片癥狀Fig.2 The symptoms of the leaves after being inoculated

2.4 病原菌的形態特征

該病原菌在PDA培養基上菌落平展，絨狀，近圓形。菌落灰白色，邊緣白色，背面褐色（圖3a）。菌絲灰白色，具隔分支。分生孢子梗分化明顯，單生或簇生，直或略彎，分隔，偶分支，淡褐色；分生孢子串生，形狀有近橢圓形、卵形、倒棒狀形，淡褐色到黃褐色，分生孢子光滑或極少數具瘤。在PCA＋濾紙上，成熟的分生孢子具有4～7個橫隔膜，縱或斜隔膜0～4個，常有1～4個主橫隔膜因較粗而色深，分生孢子大小為（21.93～44.63）μm×（7.80～11.62）μm。喙以及柱狀假喙，顏色比孢身淺，無隔膜或有1個隔膜，喙大小為（3.2～12.15μm）×（2.0～4.00）μm（圖3b）。在PCA＋濾紙培養中，5d內可形成超過10個孢子連接而成的鏈狀，多數孢子只在假喙頂端次生產孢，個別分生孢子側向次生產孢，多數分生孢子長鏈不分支，個別孢子鏈有側鏈，側鏈上1～5個孢子串生（圖3c）。分生孢子梗從主菌絲上直接產生，直立，偶分支、分隔、淡褐色。

根據孢子形態特征，結合《中國真菌志》，可將病原菌初步鑒定為半知菌亞門（Deuteromycotina），絲孢綱（Hyphomycetes），絲孢目（Hyphomycetales），暗色菌科（Dematiaceae），鏈格孢屬（Alternaria），結合其產孢表型進一步將其鑒定為細極鏈格孢［Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire］。

圖3 病原菌形態特征Fig.3 Morphology of the pathogen

2.5 三葉木通病原菌rDNA－ITS區擴增和序列分析

以病原菌DNA為模板，用真菌通用引物ITS1／ITS4對其rDNA－ITS區進行PCR擴增，得到一個長度為541bp的擴增片段（圖4）。將擴增的PCR產物進行測序，得到rDNA－ITS區序列。用BLAST在GenBank中搜索同源序列，進行比對和分析。該菌株與細極鏈格孢［Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire］（JN986764.1）相似性為99%，所得分值為977；與鏈 格 孢 ［Alternaria alternata（Fr：Fr.）Keissler］（JN618076.1）和 蕓 苔 鏈 格 孢 ［Alternaria brassicae（Berk.）Sacc.］（JN108903.1）的相似性為99%，所得分值為974；與蔥鏈格孢［Alternaria porri（Ellis）Ciferri］（JF422730.1）相似性均為99%，所得分值為966。該病原菌與已登錄注冊的細極鏈格孢（A.tenuissima）（GenBank登錄號JN986764.1）比對所得分值最大，相似度最高。構建的系統進化樹中，聚類結果顯示，該病原菌（聚類圖中以The pathogen代替）與A.tenuissima、A.alternata、A.brassicae、A.porri聚為一類（見圖5），而與另外的鏈格孢屬不同菌株及另外兩個形態相似屬菌株分開。

圖4 rDNA－ITS區擴增片段電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of rDNA－ITS PCR products

圖5 病原菌rDNA－ITS區系統進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the pathogen based on rDNA－ITS sequences

3 討論

目前報道的三葉木通病害為炭疽病和褐斑病。炭疽病開始癥狀為褐色壞死小斑，隨后，病斑中央變為淺灰白色，潮濕條件下，病斑上出現包含橙色到橙紅色孢子的子實體。褐斑病有時微顯輪紋，隨著病斑數量增多、面積增大，一些病斑可相互連成不規則的大病斑，葉片成為畸形。褐斑病的癥狀與葉斑病癥狀存在差異，葉斑病病斑無輪紋，發病葉片為正常形態，但這兩種病害病癥所表現的顏色很相近。通過對鎮安人工栽培地三葉木通葉斑病病原菌的分離與初步形態鑒定，發現葉斑病病原菌為鏈格孢屬中的一種。

在本研究菌株的分子鑒定中，該菌株序列與鏈格孢、蕓苔鏈格孢、細極鏈格孢等的序列相似性均為99%，僅借助ITS序列無法將該菌株準確鑒定到種。準確鑒定該病原菌需結合菌株形態學特征，尤其是產孢表型。這與孫霞［13］等人的研究結果相似，rD－NA－ITS區段DNA序列差異對鏈格孢（特別小孢子種）提供的遺傳信息少，其進化未達到判定種間差異的程度，不能單獨作為鏈格孢種級分類的有效手段，必須結合其顯微形態特征。

根據張天宇主編的《中國真菌志》（第十六卷）［10］，鏈格孢（A.alternata）具特征性的短分支的孢子鏈，一般做合軸式延伸，孢子鏈類似小樹叢狀；蕓苔鏈格孢（A.brassicae）具有橫隔6～11個，孢子單生；蔥鏈格孢（A.porri）具有橫隔5～11個，孢子單生，罕見鏈生；而我們分離到的該菌株孢子橫隔數為4～7個，5d內可形成超過10個孢子連成的孢子鏈，主鏈上罕見分支，這與Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire的孢子形態及產孢表型相同。在blast序列比對結果中，該病原菌與登錄號為JN986764.1的一株A.tenuissima最為相似；雖然聚類分析顯示該病原菌與A.tenuissima、A.alternata、A.brassicae、A.porri聚為一類，但結合4株鏈格孢屬真菌的孢子形態特征及產孢表型可將它們準確區分開。所以綜上所述，將該病原菌鑒定為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，暗色孢科，鏈格孢屬的細極鏈格孢（A.tenuissima）。

本研究通過病原菌的產孢表型與rDNA－ITS區序列對其準確鑒定，為其有效的防治與深入研究提供了重要基礎。

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第二十九卷）［M］.北京：科學出版社，2001：4－9.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版一部）［M］.上海：中國醫藥科技出版社，2010：59.

［3］ 高慧敏，王智民.木通屬藥用植物研究進展［J］.中國中藥雜志，2006，31（1）：10－14.

［4］ Yoshinori Kobayashi，Takanori Tsukamoto，Naohiko Miyai，et al.Anthracnose of three－leaf akebia （Akebia trifoliata Koidzumi）caused by Colletotrichum acutatum［J］.Journal of General Plant Pathology，2004，70（5）：295－296.

［5］ 梁志懷，魏林，彭俊彩，等.人工栽培三葉木通褐斑病病原菌鑒定及防治藥劑室內篩選［J］.植物保護，2009，35（4）：158－161.

［6］ 陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用［J］.安徽農業科學，2007，35（13）：3785－3786.

［7］ 徐文耀.普通植物病理學實驗指導［M］.北京：科學出版社，2006：122－123.

［8］ 方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，2007：122－145.

［9］ 劉芳，高原，張競頤，等.北京地區非洲菊葉斑病病原菌鑒定［J］.菌物學報，2010，29（1）：22－26.

［10］張天宇.中國真菌志（第十六卷）［M］.北京：科學出版社，2003：1－200.

［11］楊建雄.生物化學與分子生物學實驗技術教程（第二版）［M］.北京：科學出版社，2009：92－93.

［12］張錚，王強.三葉木通總DNA提取方法的比較［J］.西北農業學報，2005，14（3）：141－144.

［13］孫霞.鏈格孢屬真菌現代分類方法研究［D］.泰安：山東農業大學，2006：98－117.

［14］White T J，Bruns T，Lee S.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes［M］∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR protocols：A guide to methods and applications.San Diego：Academic Press，1990：315－322.

［15］沈瑞清，康萍芝，張麗榮.鏈格孢屬Alternaria nees與形態相似屬區別的研究進展［J］.寧夏農業科技，2003（6）：60－62.