番茄品種浙粉702 DNA指紋圖譜構建

阮美穎，葉青靜，王榮青，姚祝平，周國治，萬紅建，楊悅儉

(1．浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2．浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

番茄 (Solanum lycopersicumMill．)在蔬菜中占有舉足輕重的地位，全國番茄年種植面積66.7萬hm2，產值400億元。但番茄業的發展受諸多不利因素的制約。目前，番茄黃化曲葉病毒病(TYLCVD)是制約番茄生產的不利因素之一，這種病害分布廣泛，危害重，造成產量銳減。防治番茄黃化曲葉病毒病最為有效的途徑是培育優良的抗病品種。

浙粉702為浙江省農業科學院新育成的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種，長勢強，成熟果粉紅色，商品性好，抗病性強，抗番茄黃化曲葉病毒病、葉霉病和枯萎病等，深受種植者青睞，推廣應用面積不斷增加，制種量也增加。但在制種過程中，常因機械混雜、去雄不徹底或者去雄不及時等原因，會發生種子混雜或者假雜種現象，種子純度受影響。種子純度的降低會明顯降低品種的產量和品質，因此，種子純度鑒定是浙粉702推廣的重要保障。分子標記技術可快速鑒定番茄種子的純度，1998年欒雨時等［1］利用 RAPD技術鑒定番茄種子純度。本研究旨在利用CAPS和SSR分子標記技術構建番茄品種浙粉702及其親本的DNA指紋圖譜，探索適合室內使用的番茄雜種純度快速鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19由浙江省農業科學院蔬菜研究所提供。TaqDNA聚合酶、dNTP、KpnI、XbaI、ScaI、Hin6I 及SmaI 為TAKARA公司產品，HindIII、TaqI和EcoRI為上海生物技術有限公司產品，HinfI、RsaI和Hpy188I為NEB公司產品，引物由上海生物技術有限公司合成。

1.2 基因組DNA快速提取

浙粉702、Z3及7969F2-19基因組總 DNA的提取參照周國治等［2］方法。

1.3 引物

從 http://solgenomics．net/獲得 SSR、CAPS和RFLP標記，并對RFLP標記cLET-1-I13、cLEG-31-P16、T0693和TG590的核苷酸序列進行引物設計，引物序列并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 PCR反應及電泳

PCR反應體系。20～80 ng DNA模板，上游引物與下 游引物各 0.25 μmmol· L－1，0.2 mmol·L－1dNTPs，2 mmol·L－1Mg2+，1 × 反應緩沖液，1UTaq酶，加水補足至總體積為20 μL。

PCR反應條件。94℃ 3 min;94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 50 s，循環 35次;72℃延伸10 min。

電泳檢測。提取的番茄基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將SSR引物擴增的PCR產物10 μL與1 μL上樣緩沖液混勻，經8%

CAPS酶切。TaqI限制性內切酶在65℃下酶切5 h，其他內切酶在37℃酶切5 h。酶切后的PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態性。

1.5 DNA指紋圖譜的構建與驗證

對浙粉702、Z3及7969F2-19的基因組 DNA進行PCR擴增，篩選出互補差異條帶，構建浙粉702的DNA指紋圖譜。在浙粉702種子中混合Z3和7969F2-19的種子，定向驗證浙粉702 DNA指紋圖譜。在浙粉702種子中摻入浙雜203、浙砧204、浙粉209、浙粉208、浙雜301和809的種子，進行盲樣檢測和真偽驗證。

1.6 浙粉702種子純度鑒定

用建立的浙粉702DNA指紋圖譜對來源不同地區、不同制種戶及不同批次的浙粉702進行純度鑒定，并與田間形態、抗性等鑒定結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 番茄品種基因組DNA的提取

采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，結果 (圖1)顯示，采用CTAB法提取番茄試驗樣品 (父母本及雜交種)的DNA，為1條清晰完整的DNA帶，沒有降解，所提DNA質量較高。

2.2 SSR和CAPS標記的篩選

PCR反應體系中主要成分對擴增結果影響較大，因此，在篩選標記前，對PCR反應體系中模板濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、dNTP濃度、Mg2+離子濃度以及循環次數、退火溫度等因素進行了研究，從而建立優化的番茄PCR擴增反應體系。

圖1 采用CTAB法提取番茄樣品的DNA電泳結果

通過來自 http://solgenomics．net/網站標記的篩選，經過多次重復和比較，最終確定帶型清晰、穩定性好的13個SSR標記和17個CAPS標記作為鑒定浙粉702番茄品種的標記。多數SSR引物對樣品擴增出2條以上的條帶，片段的大小為50～500 bp(圖2);多數 CAPS標記的 PCR產物經酶切后有2條以上的條帶，片段的大小為50～2 000 bp(圖 3)。在篩選引物的過程中，發現雜交種與雙親之間的帶型有以下幾種類型:雜交種與雙親帶型相同;雜交種出現偏父本型條帶;雜交種出現偏母本型條帶;一親本為強帶，另一親本無帶，雜交種介于中間的所謂中間型雙親均為弱帶而雜交種為強帶的增強型;雜交種比雙親多條帶少條帶類型;雜交種與雙親有互補帶型。這幾種類型中，用于雜交種純度鑒定最理想的帶型是互補帶型，這種帶型能將雜交種與雙親明確區分開。篩選出的 SSR標記 SOL3194F3/R4、SOL3194F2/R2、TGS2216F4/R4、C2_At3g56230F/R、CAPS標記C2_ At3g56040F1/R4、 C2_ At3g56040F2/R3、cLEG-31-P16F3/R2、cLET-1-113F1/R1可以將浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19完全區分開，父母本與雜交種具有互補帶型 (圖2)。

圖2 番茄SSR標記的篩選結果

圖3 番茄CAPS標記的篩選結果

2.3 定向實驗檢測種子純度

在浙粉702種子中摻入親本種子進行盲樣檢測，結果 (圖4)與實際情況相符，4和7是父本，12是母本，1，2，3，5，6，8，9，10，11是浙粉702，表明建立的指紋圖譜能有效檢測出親本。

2.4 種子真偽鑒定

圖4 利用引物TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4鑒定浙粉702及其親本

圖5 用TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4鑒定浙粉702種子的真偽

用構建的指紋圖譜對浙粉702番茄品種進行種子真偽鑒定，結果 (圖5)表明，用TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4構建的浙粉702的指紋圖譜能較好的區分浙粉702和其他番茄品種。1，2，3，7，8，10是浙粉 702，4是浙雜 203，5是浙砧204，6是浙粉209，9是浙粉208，11是浙雜301，12是809。

2.5 浙粉702種子純度鑒定

用構建的浙粉702指紋圖譜鑒定不同制種戶的浙粉702生產種。抽取2批，每批隨機檢測100個雜交種。第1批檢測出2個混雜的種子，種子純度為99%，第2批種子純度為100%，表明浙粉702生產種達到了國家規定標準。

3 小結和討論

長期以來，種子生產者、經營者、使用者和管理者期盼著對品種真實性和純度鑒定有快速、準確、經濟實用的室內檢測方法。隨著DNA指紋技術的迅速發展，為快速、簡便、準確鑒定品種真實性和純度提供了技術支撐。在多種分子標記技術中，RAPD-PCR技術由于費用低、分析快、操作簡便等優點，適合構建特定品種的指紋圖譜，現已廣泛應用于小麥［3］、大麥［4］、玉米［5］及水稻［6］等作物種子純度鑒定。但是RAPD-PCR的多態性不太高，并且穩定性和重復性較差，而CAPS和SSR技術，呈共顯性遺傳，易于分析，穩定性和重復性較好，具有信息含量高等特點，適合雜交種品種純度的鑒定。

由于國內用于番茄育種的親本材料遺傳變異幅度小，所以很多國內的番茄品種不易找到多態性的差異。篩選出能夠區分雙親和雜交種的CAPS和SSR引物是很重要的。目前，開展番茄品種純度鑒定工作，首先要利用好現有的番茄CAPS和SSR標記，再自主開發更多的CAPS和SSR標記。

本研究以浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19為試驗材料，篩選出了能夠區分浙粉702、Z3及7969F2-19的CAPS和SSR標記，建立了適合于檢測番茄種子純度的反應體系，從而為CAPS和SSR技術在番茄種子純度鑒定中的應用和推廣打下了堅實的基礎。

［1］欒雨時，蘇喬，李海濤，等．利用RAPD技術快速鑒定番茄雜種純度 ［J］．園藝學報，1998，25(3):247－251．

［2］Williamson VM，Ho J Y，Wu F F，et al．A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato［J］．Theoretical and Applied Genetics，1994，87:757－763．

［3］向太和，汪秀峰，李莉，等．利用RAPD標記對我國主栽的秈優雜交稻和其親本進行區別和鑒定 ［J］．作物學報，2000，26(3):292－296．

［4］雷開榮，林清，郝風，等．鮮食玉米渝糯7號DNA指紋圖譜建立及應用研究 ［J］．玉米科學，2006，14(1):43－45．

［5］McDonald M B，Elliot L J，Sweeney P M．DNA extraction form dry seeds for RAPD analysis in varietal identification studies［J］．Seed Science and Technology，1994，22:171－176．

［6］Tinker N A，Fortin M G，Mather D E．Random amplified polymorphic DNA and pedigree relationship in spring barley［J］．Theor AppI Genet，1993，85:976 －984．