EGF聯合HGF誘導BMSCs向神經元樣細胞分化

陳 潔，沈如娣，王璐楠，顏烯烯，羅 振，王曉明 (臺州學院醫學院，浙江 臺州 318000)

骨髓是造血組織，其內存大量的造血干細胞，可以分化成多種血細胞。1976年，Friedenstein在其研究中發現，骨髓中除造血干細胞外還存在著一類易于貼附于塑料培養板表面的細胞，此細胞具有多分化潛能，是一種干細胞，稱為骨髓間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)［2］。有研究報道BMSCs在體外培養的情況下，可被誘導分化成神經元樣細胞、骨細胞等多種成體細胞［3-5］。由于BMSCs的多分化干細胞特性及易獲得性，尤其是可誘導分化成神經元樣細胞的特性，BMSCs在腦與神經損傷的臨床細胞學治療中極具潛力，也是目前的研究熱點之一。目前關于誘導 BMSCs向神經元分化方法較多［2，4，5-7］，多為在體外培養體系加入不同的生長因子加入誘導，但誘導效率不一，更為高效率的誘導方法仍在探索中。有研究報道［6］，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，在體外培養時，可誘導神經干細胞在體外增殖，是一種必不可少的生長因子之一。同時亦有報道稱肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，在體外培養時，可以與酪氨酸激酶受體c-Met結合從而誘導神經干細胞(Neuron stem cells，NSCs)存活和分化［8-9］。BMSCs具有神經干細胞的特性，HGF是否可高效的誘導BMSCs向神經元樣細胞分化及高效的誘導途徑還未見報道。本實驗擬通過HGF可誘導神經干細胞向神經元樣細胞分化的特性，嘗試誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，擬尋找一種更為高效的BMSCs向神經元樣細胞分化的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料:成年Wistar大鼠，購自杭州師范學院動物中心。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的獲得及鑒定:將大鼠無痛處死，去皮、肌肉，分離出股骨，去骺端后，PBS緩沖液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，即骨髓溶液，約30 ml，并存儲在含肝素的試管中。吸管反復吹打，制備成單細胞懸液，然后緩慢加入淋巴細胞分離液(大鼠淋巴細胞分離液，Histopaque-1083，Sigma)，密度梯度離心，2000 rpm離心20 min。收集細胞分離液界面處的最上層和單個核細胞層，并用20 ml的 PBS再次混合。再次離心，1800 rpm離心5 min，此次只收集單個核細胞層。收集得到的細胞用PBS洗滌2次，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，加入L-DMEM完全培養液(DMEM，10%FBS，1×青霉素 -鏈霉素)重懸細胞。然后，調細胞濃度2×105，并接種到培養瓶中(T-75)，37℃，5%CO2培養箱中培養，48 h后首次換液，以后每2天換液1次。由于骨髓間充質干細胞是貼壁增殖的細胞，24 h即可貼壁，貼壁細胞多為 BMSCs。7～10 d，BMSCs增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，流式細胞術鑒定。胰蛋白酶消化3 min左右，培養液終止消化，無菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質干細胞，獲得的細胞懸液按1∶2傳代，培養7～8 d可傳代1次。傳代細胞用于誘導分化。

1.2.2 流式細胞儀鑒定獲得細胞為BMSCs:取傳代4代骨髓間充質干細胞，待細胞長到近90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細胞懸液并計數，取1×106個細胞，用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，CD45-FITC(BD 公司)，CD34-FITC(BD公司)，CD14-FITC(BD公司)的表達情況。具體操作按操作說明進行。

1.2.3 實驗分組:鑒定后的傳代細胞分為三組:A組，培養體系內加入生長因子HGF;B組，加入EGF和HGF;C組，對照組，維持傳代培養時的培養體系(DMEM培養基)，不加其他誘導因子。當BMSCs增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、分離，獲得的BMSCs細胞，繼續培養至形成1～2簇/cm2。24 h后，當BMSCs再次貼壁，并開始在培養基中生長時，分別在不同組中加入適量的生長因子，培養基為DMEM，加入EGF 10 ng/ml(Gibco BRL，Rock ville，MD，USA)，HGF 20 ng/ml(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)。換液頻次1 次/3 d，繼續培養14 d。倒置顯微鏡觀察細胞形態，免疫熒光染色、WB檢測BMSCs向神經元或神經元樣細胞分化情況。

1.2.4 免疫熒光染色技術鑒定分化細胞為神經元或神經元樣細胞:單孔細胞培養皿用于此鑒定，誘導分化在此培養皿內時行。取此皿，分化的細胞已貼附于皿底，PBS洗滌3次，5 min/次，并用4%多聚甲醛PBS溶液固定15 min。然后將其用PBS洗滌2次，5 min/次。然后，樣品用含有1%BSA和0.2%Tri-ton X-100的PBS作用5 min。一抗4℃孵育過夜。抗體為:Neuronal Nuclei(NeuN，1∶100，Chemicon Inc.);GFAP(1∶1000，Chemicon Inc.)。在熒光顯微鏡下觀察細胞。1.2.5 Western Blotting技術檢測分化細胞內神經元標志性蛋白表達情況:各組細胞經胰酶消化，經冷的0.01 mol/LPBS緩沖液洗3次，離心收集，加細胞裂解液(50 mM Tris-Cl，pH值 7.4，150 mM NaCl，5%NP-40，1 mM sodium pyrophosphate，2 mM EDTA等)裂解細胞(1ml細胞壓積加入6～10 ml裂解液)，輕輕吹打混勻，離心15 min，12000 r，取上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質總量，操作步驟按說明書進行。各組均取等量的蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉膜，轉移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色，檢測相關蛋白表達。抗體為:GFAP，Nestin，Gal C(Galactocerebroside)，and NeuN。

2 結果

2.1 BMSCs的獲得及鑒定:從骨髓中分離獲得的單個核細胞，在L-DMEM培養液(DMEM，10%FBS，1×青霉素-鏈霉素)中培養，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀態。24 h時，大部分細胞均已貼壁，細胞呈圓形，顆粒狀。7 d時，部分細胞形態由顆粒狀開始變成梭形;14 d時呈典型的骨髓間充質干細胞形態，細胞呈長梭形，并漸呈漩渦狀聚集，呈簇狀生長(圖1)。當細胞增殖至80% ～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，培養液終止消化，無菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質干細胞，獲得的細胞懸液按1∶2傳代，傳代細胞用于誘導分化。

2.2 流式細胞術鑒定獲得細胞為BMSCs:傳代4代骨髓間充質干細胞，待細胞長到近90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細胞懸液并計數，取1×106個細胞，用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，及造血干細胞的特異性標記物CD45-FITC(BD公司)、CD34-FITC(BD公司)的表達情況。結果顯示99.8%的細胞呈CD105陽性。CD45，CD34，和CD14等抗體呈陰性，提示從骨髓中分離獲得的細胞中幾乎全部為骨髓間充質細胞。

2.3 免疫熒光染色技術鑒定分化細胞為神經元或神經元樣細胞:傳代后的BMSCs，經EGF和HGF誘導2周后，取單孔培養皿，行免疫熒光染色并在熒光顯微鏡觀察。染色結果顯示:分化細胞中，A組和B組GFAP(神經膠質原纖維酸性蛋白)呈弱陽性或陽性表達，但C組(對照組)呈陰性表達;A組和B組均有NeuN陽性表達，C組仍呈陰性表達(見圖2)。提示誘導分化的BMSCs已向神經元樣細胞分化。

2.4 Western Blotting技術檢測分化細胞內神經元標志性蛋白表達情況:各組分化細胞經胰酶消化后，Western Blotting檢測結果顯示，各組均有Nestin表達;A組及B組均有GFAP、Gal C及NeuN表達，但C組未見相關蛋白表達，且B組NeuN表達量明顯高于A組(圖3)。

圖1 骨髓基質干細胞培養

3 討論

神經元是神經組織中的主要細胞，是一種高度分化的成體細胞，不可再分裂，損傷后較難恢復，故此神經系統損傷是臨床疾病中較難治療的病癥之一。由于成體神經元的不可再生性，目前臨床針對此類疾病的治療多以功能鍛煉以促進患者的恢復。亦有學者嘗試向患者的損傷部位內移植神經干細胞或胚胎干細胞，及改善受損部位神經元周圍微環境，以誘導神經干細胞或胚胎干細胞分化，進行替代性治療［10-12］。但由于胚胎干細胞、神經干細胞需從胚胎或者成年腦組織中獲得的干細胞，受法律及倫理限制，相對較難獲得。BMSCs作為一種骨髓來源的多能干細胞，即可以誘導向神經元樣細胞分化，又較易獲得，且可以直接從患者自身獲得，體外誘導后回輸患者，避免了不必要的機體排斥，是一種較為理想的治療性細胞。

圖2 免疫熒光染色結果(×400)

圖3 Western Blotting技術檢測結果

目前關于體外誘導BMSCs向神經元分化的報道較多，多為加入不同的可誘導神經干細胞向神經元樣分化的生長因子，嘗試誘導BMSCs向神經元樣細胞分化。常見的誘導用生長因子有VEGF，EGF和BDNF等。本實驗擬嘗試驗證其中一種可誘導神經干細胞向神經元分化的生長因子，HGF，是否可以誘導BMSCs向神經元樣細胞分化。實驗結果顯示:我們從骨髓中獲得的大量細胞基本上均為BMSCs(圖1);當加入誘導因子后(HGF或HGF聯合EGF)，分化細胞有突起生出，且表達相關的神經元標志物 NeuN(圖2，圖3)，提示 HGF或HGF聯合EGF均可誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，尤其是HGF聯合EGF誘導效果較為顯著。其機制為:①可能與EGF可促進干細胞類細胞增殖有關，因為以往的研究已發現BMSCs可表達 EGF 受體［6，13］;②HGF(肝細胞生長因子)具有多種功能，并在不同上皮細胞的器官發生中扮演著重要的角色，包括腎、肺、胃、腸黏膜、角膜以及皮膚表皮和皮下組織的再生［14-15］。同時在基質細胞，如成骨細胞和成肌細胞的生長與分化中也扮演著重要的角色［14］。且HGF是一種腦組均表達的稀少神經營養因子，可促進海馬和中腦內神經元的存活能力，并且可誘導新皮層中移植體突起的生長［16］。具體機制還有待于進一步研究。

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