結球甘藍雌蕊調控轉錄因子SPT基因的克隆與序列分析

楊樸麗 許俊強 劉智宇 王志敏 張丹華 湯青林 宋 明

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶 400715）

結球甘藍雌蕊調控轉錄因子SPT基因的克隆與序列分析

楊樸麗 許俊強 劉智宇 王志敏 張丹華 湯青林*宋 明*

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶 400715）

以結球甘藍E1為材料，提取花蕾總RNA，反轉錄cDNA。根據擬南芥SPT基因設計引物，采用同源克隆的方法從中克隆SPT基因序列1085 bp，開放閱讀框1062 bp。通過cDNA推導得到的氨基酸序列分析表明，BoSPT編碼353個氨基酸殘基，預測分子量為37.67 kD，pI為6.83。經過EcoRⅠ和KpnⅠ限制酶雙酶切后，構建原核表達質粒pET43.1a-BoSPT轉化表達菌株E. coli Rosetta （DE3），通過SDS-PAGE 檢測該蛋白的表達。經Smart-embl預測其具有bHLH家族結構域，位于序列第173～221位氨基酸殘基處。進化樹表明結球甘藍BoSPT與擬南芥AtSPT和筷子芥AlSPT的親緣關系較近。BoSPT基因的原核表達得到純化的融合蛋白。

結球甘藍；雌蕊；SPT；基因克隆；序列分析

雌蕊是種子植物的雌性繁殖器官，由心皮、花柱和子房組成并最終發育形成果實，其生長發育情況對作物的產量、質量都有決定性的影響，同時雌蕊發育的好壞對植物是否能夠繁殖也起到至關重要的作用。SPATULA（SPT）是第一個被發現在植物花器官發育過程中起到重要作用的基因（Alvarez ＆ Smyth，1999）。Heisler等（2001）應用原位雜交技術得出，SPT基因在花分生組織的頂部就開始表達，此部位隨后發育成雌蕊原基，SPT基因在雌蕊原基中部表達最強；隨著雌蕊原基的生長發育，隨后繼續分化出隔膜、柱頭、花柱和輸送管，在此發育過程中不同組織中都有SPT基因的表達。直至開花前，在隔膜和柱頭上SPT基因的表達才消失，但在角果瓣片上卻可檢測到SPT基因的表達，然后隨著發育的進程，SPT基因表達漸漸集中到瓣片邊緣，此部位會進一步發育成瓣片分裂區，保證果實正常開裂。在擬南芥中發現，SPT功能缺失會導致隔膜和頂端心皮融合缺陷，以及傳輸束喪失和柱頭組織發育的減少（Heisler et al.，2001；Alvarez ＆ Smyth，2002）。由此推斷，SPT基因在整個雌蕊發育過程中是必不可少的。

擬南芥心皮發育還受到花器官確定基因AGA（AGAMOUS）和MADS-box成員CRABS CLAW（CRC）基因的調控（Alvarez ＆ Smyth，1999，2002）。Alvarez和 Smyth（1999）發現CRC可抑制正在發育的雌蕊的橫向生長，促進其軸向生長。CRC基因的突變將引起雌蕊呈現較寬而短的結構，且使兩心皮在頂點處呈非融合狀態（Fourquin et al.，2007）。AGA基因在花器官建成中為C組的基因，對于維持心皮生長發育特性以及花柱頂端的生長是不可缺少的（Gloz &Hudson，2002）。有研究發現這3個基因在心皮的發育過程中是平行起作用的，而并非上下游關系，SPT與這兩個基因的并聯行為調節成熟雌蕊所有元件，也有遺傳學的證據表明CRC可以增進SPT與 AGA 的功能（Alvarez ＆ Smyth，1999；Fourquin et al.，2005）。Gremski等（2007）研究發現SPT與其他bHLH編碼的轉錄因子HECATE（HEC）在隔膜、傳輸束和柱頭重疊表達形成二聚體調控雌蕊生長發育。同時研究發現在擬南芥中SPT除了可以調控雌蕊的發育外，在子葉（Josse et al.，2011）、葉片（Jorgensen ＆ Tyers，2004；Ichihashi et al.，2010）、根（Makkena ＆Lamb，2013）、果實（Girin et al.，2011；Groszmann et al.，2011）等器官中都有作用，同時對種子的萌發也起到了一定的作用（Penfield et al.，2005）。所以可以說SPT的功能貫穿了植物的整個生命周期，但是SPT的主要功能是在雌蕊受精之前影響花器官的發育。因此對雌蕊調控轉錄因子SPT的研究是有重要意義的。

近年來，SPT在模式植物擬南芥中已有深入的研究，然而在其他作物中的報道還相對較少。擬南芥和甘藍（Brassica oleracea L.）同為十字花科草本植物，不同的是甘藍為蕓薹屬中重要的蔬菜作物。目前，趙燕等（2009）從薺菜（Capsella bursapastoris）中克隆到了與SPT相關的同樣影響雌蕊發育過程的CRC基因，但甘藍SPT基因的研究至今仍未見報道。本試驗根據擬南芥SPT基因設計引物，通過同源克隆法從試驗材料結球甘藍E1中得到了SPT基因。進一步對其進行序列分析及同源性對比，結合原核體外表達技術，為后續在甘藍中SPT與其他蛋白如HEC的相互作用調控雌蕊生長發育的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

結球甘藍E1由重慶市蔬菜學重點實驗室提供。種子播種和植株生長均在RXZ 型智能人工氣候箱中，采用20℃/16 h光照與18℃/8 h黑暗的光周期，成苗后移栽于試驗田，經過冬季低溫春化。2013年3月取盛花期自交不親和系花柱于-80℃凍存，用于RNA提取。

根據擬南芥SPT基因序列（NCBI 登錄號NM_119857.2）設計引物對。SPT-F：5′-GCGgA ATTCATGGGAGATAAGAAATTGAT-3′；5′為帶保護堿基的EcoRⅠ酶切位點；SPT-R：5′-GCGgGTACCATGGATTCTGACATAATGAACA-3′；5′為帶保護堿基的KpnⅠ酶切位點。

1.2 花蕾SPT基因的cDNA和gDNA的克隆與序列分析

根據擬南芥基因保守區域設計PCR 擴增引物BoSPT-F 和BoSPT-R用于cDNA 序列的擴增，RT-PCR 擴增體系為ddH2O15.4 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，2mmol·L-1dNTP2.5 μL，25mmol·L-1mgSO41.6 μL，BoSPT-F/BoSPT-R 各1 μL，KODdNA 聚合酶0.5 μL，模板dNA0.5 μL。PCR 擴增程序為94℃3min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，38 個循環；72℃5min。回收目的片段分別連接到pEASY-Blunt simple 載體，轉化至E.coliJM109感受態細胞，進行藍白斑篩選后，挑取陽性克隆進行酶切鑒定并送測序。

1.3 表達質粒的構建與體外表達

使用OMEGA Plasmidminiprep 試劑盒提取SPT目的基因質粒，分別經EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切后定向插入原核表達載體pET43.1a，重組質粒轉化大腸桿菌JM109。提取重組質粒并命名為pET43.1a-BoSPT分別經EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定和華大基因公司測序驗證。

將重組質粒pET43.1a-BoSPT轉化表達菌株E. coliRosetta （DE3）。挑取單菌落，接種于5mL含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB 液體培養基，37℃振蕩培養過夜。次日，過夜培養物按1︰100擴大培養，當OD600在0.8～1.0時加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），按照L9（34）正交設計篩選融合蛋白表達條件（表1）。

表1 IPTG誘導原核表達條件的正交設計

1.4 融合蛋白純化

由1.3中確定的最佳條件培養含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3），并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒說明純化其體外表達的重組蛋白產物。誘導結束后離心收集菌體，使用Ni2+-NTA 柱（Qiagen）純化融合蛋白，以轉化pET43.1adNA空載體的E. coliRosseta 作為對照，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。

2 結果與分析

2.1 BoSPT基因克隆

提取花蕾RNA（圖1）反轉錄cDNA，設計引物克隆得到BoSPT基因cDNA序列，全長1085 bp，開放閱讀框（ORF）1062 bp（圖2），GC含量54.37%。根據其cDNA序列推導得到BoSPT蛋白共353個氨基酸殘基序列，預測分子量為37.67 kD，等電點為6.83。

2.2 BoSPT基因序列分析

通過SignalP分析（http://genome.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-2.0/）該蛋白不含信號肽，PSORT及（TargetP http://genome.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）軟件預測亞細胞定位表明，BoSPT蛋白位于細胞核中的可能性最大，在其他部位可能性較小，說明BoSPT蛋白是一種核蛋白且由7個外顯子組成，編碼353個氨基酸。

圖1 甘藍總RNA電泳圖譜

圖2 SPT基因cDNA PCR產物電泳圖譜

在線預測分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）表明，BoSPT蛋白具有bHLH家族結構域，位于第173～221位氨基酸處，兩親性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸殘基，是蛋白-蛋白相互作用的位點，且保守的兩親性螺旋可能也與共激活子蛋白作用。酸性結構域（ETDGYDCESEEGVE）位于第139～152位氨基酸處，富含酸性殘基。兩個核定位信號（KRCR、KRRR）分別位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸處，該區域對SPT功能非常重要。Beta鏈位于第222～230位氨基酸處。跨膜域分析表明（http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），該蛋白不含跨膜區，且位于膜外（圖3）。

圖3 SPT核苷酸序列分析

2.3 BoSPT磷酸化位點預測

用NetPhos2.0 Serve 軟件預測BoSPT基因翻譯后修飾，結果顯示BoSPT蛋白有可能發生磷酸化的位點共有36個（圖4）。絲氨酸（Ser）有可能發生磷酸化的位點有31 個，分別在肽鏈的第9、10、12、15、22、25、31、32、48、49、53、61、85、102、125、130、131、132、133、137、148、167、168、180、186、202、209、276、296、309位和第314位氨基酸處；蘇氨酸（Thr）可能發生磷酸化的位點有3個，分別在肽鏈的第84、245位和第263位氨基酸處；酪氨酸（Tyr）可能發生磷酸化的位點有2個，分別在肽鏈的第91位和第144位氨基酸處。

圖4 BoSPT磷酸化位點分析

2.4 BoSPT進化樹分析

經氨基酸序列NCBI比對，BoSPT屬于轉錄因子超家族。序列分析結果顯示BoSPT具有動植物轉錄因子特有的bHLH結構域。從NCBI數據庫檢索到部分與BoSPT氨基酸序列同源性較高的高等植物蛋白家族氨基酸序列，經ClustalX2比對，通過MEGA5軟件構建系統發生樹（圖5），結果表明，結球甘藍BoSPT與擬南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT （XP_002866965）位于相同的進化枝上，與兩者的同源性最高（圖5）。

圖5 SPT蛋白分子進化樹分析

2.5 表達質粒的構建與鑒定

構建的表達質粒pET43.1a-BoSPT，經EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切可得到1060 bp左右條帶（圖6），表達質粒送華大基因公司雙向測序，結果插入pET43.1a載體的位點和方向完全正確。

2.6 重組蛋白的誘導表達與SDS-PAGE檢測

表達產物的SDS-PAGE 結果（圖7）顯示，有pET43.1a-BoSPT重組蛋白表達的特異條帶出現（圖7，1～9泳道），其蛋白質相對分子量均與預期值103.67 kD相符，而未誘導的菌液（對照）不見此條帶（圖7，0泳道）。由此證明表達質粒pET43.1a-BoSPT構建正確，且融合蛋白在大腸桿菌中成功表達。由圖7看出在不同的誘導條件下，該融合蛋白均有較高的表達量，第2、3、4、6、7、8、9泳道的表達量相近，而1、5泳道的表達量相對較弱。本試驗選用第7泳道（對應表1中第7組的誘導條件，即0.1mmol·L-1IPTG在37℃誘導2 h，融合蛋白表達量最高，該條件為最佳培養條件），采用TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒純化體外表達的融合蛋白pET43.1a- BoSPT，純化后可得到目的條帶。

圖7 pET43.1a-SPT不同誘導條件的SDS-PAGE電泳圖譜

圖6 pET43.1a-BoSPT酶切電泳圖譜

圖8 純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

2.7 融合蛋白純化檢測

根據2.6得出的結果確定含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3）的最佳培養條件，并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒說明純化其體外表達的重組蛋白產物。誘導結束后離心收集菌體，使用Ni2+-NTA柱（Qiagen）純化融合蛋白，以轉化pET43.1adNA空載體的E. coliRosseta 作為對照，通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白，如圖8所示，純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白目標條帶準確清晰，目標條帶預期值103.67 kD。

3 結論與討論

本試驗通過同源克隆的方法從甘藍中獲得了SPT基因，編碼了353個氨基酸。經ClustalX2比對，通過MEGA5軟件構建系統進化樹，可以看出，結球甘藍BoSPT與擬南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT（XP_002866965）的同源性最高。從而在一定程度上說明了這3個物種可能是由一個共同祖先進化而來。將試驗中克隆得到的SPT基因所編碼的BoSPT蛋白進行NCBI比對，發現BoSPT屬于轉錄因子超家族。序列分析結果顯示在第173～221位氨基酸處BoSPT具有動植物轉錄因子特有的bHLH結構域。bHLH區域含有兩個保守結構域：一個保守的兩親性分子螺旋和一個酸性域，還帶有兩個保守的在bHLH域N末端重疊的核定位序列及一個Beta鏈。因為bHLH家族結構域可能具有與蛋白或DNA結合成二聚體的能力，所以在不同的器官中所結合的蛋白與基因可能是不相同的。這便可以在一定程度上解釋了為何葉片與心皮為同源組織，但在spt突變體中，葉片形狀和葉片不同組織發育完整沒有缺陷，而在花的心皮邊際卻有特異性組織發育缺陷（Alvarez ＆Smyth，1999；Fourquinetal.，2005；Ichihashietal.，2010）。

BoSPT蛋白在第139～152位氨基酸處具有酸性結構域（ETDGYDCESEEGVE），富含酸性殘基，而SPT的酸性結構域是心皮發育所必需的（Groszmannetal.，2008）。已有研究表明SPT酸性結構域是轉錄助激活劑的作用位點。基礎轉錄機制是間接激活而不是直接激活。當然在一些轉錄因子中，酸性域也被鑒定為直接的激活子，但是這一類轉錄因子只是富含酸性殘基，而不擁有嚴格的保守序列和結構（Ptashne ＆gann，1997）。兩親性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸殘基，兩親性螺旋結構在心皮的發育過程中所起的作用并不像酸性結構域那樣是必須的，但其對酸性結構域起到支持作用（Groszmannetal.，2008）。兩個核定位信號（KRCR、KRRR）分別位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸處，Beta鏈位于第222～230位氨基酸處，有研究表明在與保守Beta鏈相鄰的bHLH的C末端的一個突變導致SPT功能缺失（Mitsuda ＆Ohme-Takagi，2009）。位于C端與bHLH 域毗鄰的Beta鏈的延伸對SPT心皮功能也是相當重要，因其位于參與二聚化作用的bHLH域下游，可能提供額外的二聚化接觸點。它與bHLH-Zip蛋白的亮氨酸拉鏈結構域的作用可能是平行的（Blackwood ＆ Eisenman，1991），都具有促進其二聚搭檔特異性的作用（Souceketal.，1998）。目前，有研究報道顯示SPT和另一個bHLH轉錄因子HEC蛋白之間存在相互作用，形成二聚體可能調控下游的目標基因（Gremskietal.，2007），然而，是否還存在其他能與SPT相互作用的蛋白還需進一步的研究。

近年來國內外的學者在擬南芥的雌蕊發育調控機制方面接連取得重大進展。這為其他作物，尤其是瓜果蔬菜等經濟類作物的研究帶來了便利（蔣勵和張小蘭，2013）。本試驗從結球甘藍中克隆得到甘藍雌蕊調控轉錄因子SPT基因并對其蛋白進行體外原核表達檢測，可得到純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白且目標條帶準確清晰。表明SPT能在體外表達。下一步將對SPT基因所表達的蛋白與其他蛋白的相互作用進行進一步的研究，更加深入地了解SPT基因調節雌蕊發育的分子機制。為全面了解甘藍開花調控機制，并通過分子生物學方法來調控結球甘藍的雌蕊發育使達到生產、育種目標奠定了理論基礎。

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Moclecular Cloning and Sequence Analysis of SPTgene Transcription Factor Regulation of Pistil from Cabbage

YANG Pu-li，XU Jun-qiang，LIU Zhi-yu，WANG Zhi-min，ZHANGdan-hua，TANG Qing-lin*，SONGming*
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for Southernmountainous Regions，Ministry of Education，Key Laboratory of Olericulture，Chongqing400715，China）

Taking cabbage（Brassica oleracea L.） E1 asmaterials，We extracted total RNA from capullo，reverse transcribed cDNA. According to SPTgene sequence of Arabidopsis，primers weredesigned and1085 bp SPTgene with1062 bp open reading frame（ORF）was cloned by homology cloning techniques. Thededuced BoSPT protein contained353 amino acids，with amolecular weight of37.67 kD and pI of6.83. Afterdouble enzyme of EcoRI and KpnI restriction enzymes，and then construct the recombinant plasmids pET43.1a-BoSPT. After transformation to E. coli Rosetta （DE3），the expression of recombinant proteins weredetected via SDS-PAGE. The structural analysis of BoSPT though Smart-embl showed that it contained bHLH familydomain，which located at the position of173-221 amino acid residues，The phylogenetic tree indicated that the BoSPT had closegenetic relationship with AtSPT and AlSPT. Prokaryotic expression showed that themolecularmass of BoSPT protein was purified.

Cabbage；Pistil；SPT；Moclecular cloning；Sequence analysis

S635.1

A

1000-6346（2013）20-0024-08

2013-06-22；接受日期：2013-08-14

國家重點基礎研究發展計劃項目（2012CB113900），國家自然科學基金項目（31000908），重慶市自然科學基金項目（2011BA1002），中央高校基本科研業務費專項（XDJK2012B020），國家大學生創新項目（201210635045）

楊樸麗，女，專業研究生，專業方向：蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail：yangpuli2008@163.com

*通訊作者（Corresponding authors）：湯青林，男，副研究員，碩士生導師，專業方向：蔬菜遺傳育種與發育調控，E-mail：swutql@163.com；宋明，男，教授，碩士生導師，專業方向：蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail：swausongm@163.com