耐UV輻射微生物高通量篩選模型的建立及初步驗證

張志東，朱 靜，顧美英，王 瑋，石勁松，謝玉清，唐琦勇，宋素琴

（1.新疆農業科學院 微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆醫科大學 第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830091）

自1956年美國Anderson首次發現極端耐輻射微生物——耐輻射奇球菌（Deniococcus radiodurans）以來［1］，世界各國已從不同地區、不同環境分離出Deniococcus屬標準模式種40余個［2］。除此之外，其他屬如：Rubrobacter、Acinetobacter 、Chroococcidiopsis、Hymenobacter、Kineococcus、Kocuria、Methylobacte－rium、Thermococcus等屬多種微生物也具有較強的耐輻射特性［3］。研究表明，耐輻射微生物除具有極強的抗輻射特性外，其特殊的生命現象、生理機制，以及在環境工程、人類健康、生物技術乃至軍事、地外空間等方面的應用前景，也成為科學界關注的熱點［4－7］。

1 耐UV輻射微生物簡介

雖然從γ射線與UV線（紫外線）輻射造成的微生物致死的機理來看，γ射線為一種強電磁波，當進入微生物細胞內部后，主要通過電離作用后的離子作用于如蛋白質、核酸和酶等有機分子，而使其變性或突變，進而使細胞失去活性［8］；UV輻射細胞主要作用于DNA，造成DNA的突變和失活［9］。兩者機理不同，但研究發現，大多數耐γ射線輻射微生物均具有不同程度的耐UV輻射特性，并且兩者之間存在著一定的正相關特性［10］。耐UV輻射微生物的篩選因不需要特殊的實驗設備，且操作條件要求簡單，所以可以更加方便、容易地通過對耐UV輻射微生物的篩選獲得耐γ射線輻射微生物。

目前，耐UV輻射微生物的篩選主要通過菌株的UV輻照時間－存活特性來確定［11－13］。這一方法存在工作量大、時間長以及耗材多等缺點，僅適合對少量特殊耐輻射微生物的鑒定和抗輻射特性的研究使用，而對大量菌株的篩選較為困難。因此，本研究利用96孔板與菌液點板法，通過對各影響因素的分析和優化，建立耐UV輻射微生物高通量篩選模型。

2 材料

（1）大腸桿菌 DH5α（E.coli DH5α）和耐輻射奇球菌（Deniococcus radiodurans）均為我所菌保室保存。

（2）培養基。LB培養基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 5g，純凈水1000mL，pH 7.0。TGY培養基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，葡萄糖2g，純凈水1000mL，pH 7.5。

3 方法

3.1 微生物的培養

從新鮮斜面刮取輻射敏感菌大腸桿菌DH5α（E.coli DH5α）一環，劃線接種至LB培養基平板上，置于37℃恒溫培養12h后取出備用。從上述新鮮培養物中，調取單菌落接種至LB液體培養基中，于37℃、180r／min恒溫震蕩培養12h，菌液于5000r／min下離心5min后棄上清，菌體備用。

新鮮斜面刮取輻射抗性對照菌株D.radiodurans一環，劃線接種至TGY培養基平板上，置于30℃恒溫培養72h后取出備用。從上述新鮮培養物中，調取單菌落接種至LB液體培養基中，于30℃、180 r／min恒溫震蕩培養72h，菌液于5000r／min下離心5min后棄上清，菌體備用。

3.2 懸浮液及菌體濃度的選擇

分別選取0.05mol／L、pH值為7.2的磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水以及Biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠作為懸浮液，分別在200～400nm內進行波長－吸光度掃描。并將前面所述離心收集的菌體混勻，分別配置成不同的菌體濃度，將分光光度計樣品槽調至狹縫進光后，于波長600nm下進行樣品的時間－吸光度值進行掃描，并記錄數據進行分析。

3.3 加樣位置對輻射效果的影響

分別吸取上述制得的菌懸液67μL，加樣于無菌96孔板的中心以及4個角，于超靜工作臺的15W紫外燈下，垂直距離30cm處進行輻照，每間隔一定時間取樣2μL，并點樣于LB培養平板上，置于37℃恒溫培養12h后，觀察菌落形態的不同［14］。

3.4 菌體培養方式對輻射效果的影響

挑取前述菌種新鮮培養物一環至無菌0.02mol／L、pH 7.2的磷酸鉀緩沖液中，混勻并洗滌3次重懸后，吸取菌懸液加入無菌96孔板中，置于酶標儀于600nm下測定OD值。通過分析測定菌液的OD值，對菌懸液進行適當稀釋至后備用。

分別吸取平板培養和液體培養制得的相同濃度菌懸液67μL加入于另一無菌96孔板中心，置于超靜工作臺的15W紫外燈下，垂直距離30cm處進行輻照，每間隔一定時間取樣2μL，并點樣于LB培養平板上，置于37℃恒溫培養24h后，觀察菌落數量的不同。

3.5 輻照效果的驗證

分別以D.radiodurans和E.coli作為驗證菌株，收集液體培養基中新鮮培養的各菌的菌體，以用0.05 mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）洗滌菌體3次，并調整至濃度0.5OD600。分別取10mL菌懸液置于9cm培養皿中，放置于15W紫外燈下30cm處，黑暗振蕩輻照處理［13］，每間隔一定時間取樣2μL，并點樣于LB培養平板上，置于30℃恒溫培養一定時間后，觀察菌落形態的不同，并對本研究建立的實驗方法進行驗證。

4 結果與分析

4.1 輻射模型條件的確定

4.1.1 懸浮液的確定

在本實驗模型中因使用96孔板，無法進行電磁攪拌。為了使在輻射過程中菌液相對均勻，本實驗對懸浮液和菌體濃度進行了分析。實驗首先選取0.02 mol／L、pH 7.2的磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水以及biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠作為懸浮液，分別在200～400nm下進行波長－吸光度掃描。實驗結果發現Biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠在200～250 nm范圍內有明顯的吸收峰，因而不適合作為耐UV輻射菌篩選中的懸浮液（見圖1）。而磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水均無吸收，考慮實驗過程中菌體自身釋放的代謝物質或因紫外輻射造成菌體物質或代謝物質的釋放造成pH的變化，因此本研究優先使用0.02 mol／L、pH 7.2的磷酸緩沖液［12］。

4.1.2 菌懸液濃度的確定

目前文獻有關耐UV輻射菌的研究中為了使菌體在輻照時間內保證菌液均一性，往往需要使用電磁攪拌器進行攪拌［11－12］。在本實驗模型中因使用的為96孔板，無法進行電磁攪拌。為了使在輻射過程中菌液相對的均勻，本實驗對懸浮液和菌體濃度進行了分析。

圖1 10%吉冷膠的波長－吸光度掃描曲線

以D.radiodurans和E.coli為實驗菌，分別使用0.05mol／L磷酸緩沖液（pH 7.2）配置成0.5OD600和1.0OD600菌懸液，將分光光度計樣品槽調至狹縫進光后，于波長600nm下進行樣品的OD－時間掃描，并記錄數據（見圖2）。由圖2可以看出，在實驗時間內，不同濃度的E.coli菌懸液，其上層吸光度幾乎不變。對于不同濃度的D.radiodurans菌懸液來說，1.0 OD600的菌懸液在靜置過程中上層吸光度會不斷降低，當達到0.9OD600后下降趨勢變慢；而0.5OD600菌懸液在實驗過程中幾乎無變化，因此，選擇0.5OD600菌懸液為實驗菌體濃度。

圖2 不同懸浮液下菌體OD－時間的描曲線

另外，通過計算和測量常規UV輻射時10mL菌懸液置于9cm培養皿時菌液厚度，得到在96孔板條件下加67μL與菌液厚度相當，并通過游標卡尺測量數據一致，因此后續實驗菌液的加樣量取67μL。

4.1.3 加樣位置對輻射效果的影響

UV輻射的劑量率主要與紫外燈的功率、輻射距離有關。在紫外燈功率一定下，輻射劑量與輻射距離平方成反比。考慮到當96孔板至于燈管正下方且與燈管方向平行時，96孔板中心線與邊線與燈管距離的不同，可能帶來輻射效果的不同。實驗以輻射敏感菌E.coli為實驗菌，分別對96孔板的特殊位置，即4個角A1、A12、H1、H12及中心區域點E6分別加樣67 μL，于超靜工作臺下輻照一定時間后取樣2μL，并點樣于LB培養平板上，恒溫培養后觀察菌落數量的不同（見圖3）。由圖3可以看出，上述5個位置中樣品分別照射60s和75s后菌量數基本一致。

分析原因為，盡管邊線和中心線到燈管距離存在不同且成一定角度，經計算邊線到紫外燈的距離為30.15cm，按劑量率與距離的平方計算，邊線的劑量率約為中心線的99.01%，如再考慮到燈管自身的直徑，劑量率相差將更小，因此在不同點上輻射結果類似，可以認為在本實驗條件下，紫外燈照射在96孔板上每個孔的劑量率是相同的。

圖3 不同位置對紫外輻射效果的影響

4.1.4 菌體培養方式對輻射效果的影響

在常規UV輻射時，一般選擇使用液體搖瓶培養菌體到對數期后期收集菌體，通過洗滌和重懸后，進行UV輻射。上述方法對于大量篩選耗時耗力，特別是在本模型中僅需少量菌體的情況下，尤顯耗材多。因此本實驗以輻射敏感菌E.coli為實驗菌，分別對液體培養和固體培養的菌體，菌體洗滌重懸后加入96孔板中進行輻射，并以常規方法（液體培養）進行輻射作為對照驗證，結果見圖4。由圖可以看出三者的結果一致。因此，在本模型中可利用平板或斜面培養的菌體進行耐UV輻射菌的篩選。

圖4 不同培養方式對紫外輻射效果的影響

4.2 輻照效果的驗證

為了進一步驗證模型的可靠性，分別以耐輻射菌D.radiodurans作為驗證菌株，收集菌株在平板上新鮮培養的菌體，以0.05mol／L磷酸鉀緩沖液（pH7.2）洗滌菌體3次，并調整至濃度0.5OD600，吸收67μL置于96孔板的孔中上樣。然后放置于15W紫外燈下30cm處，黑暗振蕩輻照處理，每間隔一定時間取樣2μL，并點樣于LB培養平板上，置于30℃恒溫培養一定時間后，觀察菌落形態的不同。同時，以傳統方法，即利用液體培養收集洗滌菌體，并配制相同濃度的菌懸液，分別取10mL菌懸液置于9cm培養皿中輻射作為對照，結果見圖5（圖中A為傳統方法，B為本模型方法）。由圖5可以看出，兩者結果一致，證明本模型具有可靠性。

圖5 基于D.radiodurans的模型驗證

4.3 耐UV菌的高通量篩選及進一步的驗證

挑取從輻射污染地區及周邊分離出的96株細菌，分別制得相同濃度的菌懸液，以耐輻射菌D.radiodurans耐輻射劑量為參考，以UV輻射20min為處理時間，隨后取樣點板，并置于恒溫培養箱培養，并觀察實驗結果。隨機挑取一株不產芽孢的耐UV輻射菌株，利用傳統方法進行輻射存活率驗證，結果見圖6。由圖6可以看出，驗證菌株的確具有耐受20min的特性，因此也再一次證明模型的可行性。

圖6 菌株T93的耐UV輻射曲線

4.4 篩選模型的進一步優化

在利用前述的篩選模型條件下，實驗前期發現分離獲得大量的芽孢桿菌。通過實驗觀察，除芽孢桿菌自身營養體具有一定的耐UV輻射特性外，另與平板培養時間控制不當、造成菌落大量產生芽孢有關。因為芽孢本身具有極強的抗紫外等抗逆性，造成實驗篩出結果偏高。因此在后續實驗操作過程，一方面可通過密切觀察相關菌種的生長情況，及時鏡檢避免上述情況。在實際操作中，一般選擇菌落形成不久即進行輻射處理。另外，為了節約時間和工序，可單獨將產芽孢的菌株拿出，單獨進行篩選。

由前期實驗可知，在前述模型下96孔板上紫外輻射劑量率近似均勻。實驗設計了一個簡單裝置（見圖7），即在原有的96孔板外層包裹了一層鋁箔紙，且鋁箔紙可以按實驗所需抽動。在同一菌株不同時間紫外照射時，可事先在實驗所需的孔中加入菌懸液，操作時只需每隔一定時間抽出一個孔的距離，待實驗結束后，可統一進行點樣。其中最后一個未輻射樣為零時間處理，第1個樣為最長時間處理。用上述方法不僅進行一步簡便了處理步驟，同時也減少了操作工序。

圖7 實驗模型所用裝置

5 結論

耐輻射微生物作為特殊環境微生物，與其相關的研究具有極其重要的意義，業已成為微生物學研究熱點之一。針對耐輻射微生物的耐γ射線輻射特性和耐UV輻射特性的相關性，及傳統耐UV輻射微生物篩選費時、費力和費材的缺點，設計了一種基于96孔板的高通量篩選方法。通過不同菌的實驗驗證，及該模型篩選菌的耐UV特性研究表明，該模型方便可行，為高通量篩選耐UV輻射菌的篩選提供了可能。

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