油茶餅粕中茶皂素醇提工藝條件優(yōu)化

謝 多 趙 儉 許小彤 廖秋林 李加興

（吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000）

油茶餅粕又稱茶餅、茶粕、枯餅，含有粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、皂素、糖類、灰分、單寧、咖啡堿等成分，具有很高的綜合利用價(jià)值，可用于提取茶皂素、作為飼料添加劑及栽培食用菌等［1，2］。

茶皂素又名茶皂甙，是從山茶科山茶屬植物中提取得到的五環(huán)三萜類糖甙化合物，易溶于水、甲醇、含水乙醇和正丁醇［3］。茶皂素是一種性能優(yōu)良的非離子表面活性劑，具有較強(qiáng)的發(fā)泡、乳化、分散、濕潤等作用，并具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等生理活性，可用來制造各類洗滌劑、化妝品、泡沫劑、防腐劑、乳化劑、殺蟲劑及其它藥劑［4，5］。因此，茶皂素可廣泛應(yīng)用于日化、建材、紡織、農(nóng)藥以及其它一些領(lǐng)域，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高［6，7］。

茶皂素在茶籽、茶葉、茶樹莖及根系中均有分布，尤以茶籽中的含量最多，油茶餅粕中的含量亦較高［8］。目前，從油茶餅粕中提取茶皂素的方法有水提法、有機(jī)溶劑法、水提沉淀法、水提醇萃法、超聲波提取法等［9］。考慮到乙醇價(jià)格低廉，來源廣泛，且較適宜于規(guī)模化提取，本研究采用乙醇作為浸提油茶餅粕茶皂素的溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化醇提條件，為油茶餅粕的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

油茶餅粕：由湘西木本世家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，為油茶籽脫殼、壓榨、取油后余下的茶籽粕。

乙醇、丙酮、無水乙醚、香草醛、茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖、濃硫酸、蒽酮、乙酸乙酯等：國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

固體樣品粉碎機(jī)：XA－1型，江蘇金壇市億通電子有限公司；

電子天平：JA2003型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF－101S型，天津科諾儀器設(shè)備有限公司；

恒溫水浴鍋：DSY－2－4型，北京國華醫(yī)療器械廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－52A型，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵：SHZ－D（Ⅲ）型，浙江黃巖求精真空泵廠；

真空離心濃縮儀：ZLS－1型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

真空干燥箱：DZF－6050型，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

可見分光光度計(jì)：722型，上海菁華科技有限公司；

醫(yī)用超聲波清洗器：KQ－250E型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程

油茶餅粕→粉碎→脫脂→干燥→乙醇浸提→抽濾→真空濃縮→加入丙酮→收集沉淀→干燥→茶皂素粗品

1.2.2 操作要點(diǎn) 用石油醚作為浸提溶劑，將粉碎后的油茶餅粕于提取溫度60℃、料液比1∶8（m∶V）的條件下脫脂6h，得到已去除殘油的油茶餅粕［10］。稱取脫脂餅粕并置于磨口燒瓶中，按一定料液比加入乙醇，在80℃水浴下回流2h，趁熱過濾，將濾液進(jìn)行真空濃縮，然后加入丙酮以沉淀出茶皂素，過濾并收集沉淀，經(jīng)50℃真空干燥即得茶皂素粗品［11］。

1.2.3 影響油茶餅粕茶皂素得率的單因素試驗(yàn)

（1）乙醇濃度的影響：分別以30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液作為浸提溶劑，在料液比為1∶10（m∶V），50℃下水浴浸提90min，探討溶劑濃度對(duì)茶皂素得率的影響。

（2）料液比的影響：分別按料液比為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14（m∶V）加入70%的乙醇作為浸提溶劑，在50℃下浸提90min，探討料液比對(duì)茶皂素得率的影響。

（3）提取溫度的影響：按料液比1∶8（m∶V）加入70%的乙醇作為浸提溶劑，分別在30，40，50，60，70，80，90 ℃水浴中浸提90min，探討提取溫度對(duì)茶皂素得率的影響。

（4）提取時(shí)間的影響：按料液比1∶8（m∶V）加入70%的乙醇作為浸提溶劑，在80℃水浴中分別浸提30，50，70，90，110，130，150min，探討浸提時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法對(duì)醇提油茶餅粕茶皂素的最佳條件優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度和提取時(shí)間這3個(gè)相對(duì)乙醇濃度對(duì)茶皂素提取得率影響更顯著的因素，根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，以茶皂素提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)分析試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.2.5 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取香草醛0.8g溶于10mL無水乙醇，配制成香草醛溶液。稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用80%乙醇溶液定容至50mL，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL置于帶塞試管中，加水至0.5mL，準(zhǔn)確加入80g／L香草醛溶液0.5mL，于冰水中加入77%硫酸溶液4mL，搖勻，于60℃加熱15min，然后置于冰水浴中冷卻10min，取出置于室溫下，用80%乙醇溶液定容至25mL，搖勻用1cm比色皿在分光光度計(jì)于550nm處測(cè)其吸光度。然后以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y＝9.16x＋0.065 4（R2＝0.993 2），如圖1所示。

圖1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of tea saponin

1.2.6 提取物中茶皂素含量的計(jì)算 稱取提取物粗品25mg，用80%乙醇溶液定容至50mL，制成茶皂素待測(cè)液，準(zhǔn)確吸取茶皂素待測(cè)液5mL茶皂素待測(cè)液，其余操作同1.2.5，根據(jù)測(cè)得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)茶皂素含量。按式（1）計(jì)算提取物中茶皂素含量。

式中：

R——茶皂素含量，%；

m1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)茶皂素含量，mg；m——測(cè)定時(shí)樣品的質(zhì)量，mg。

1.2.7 茶皂素得率的計(jì)算 按式（2）進(jìn)行：

式中：

Y——茶皂素得率，%；

m1—— 提取物質(zhì)量，g；

R——茶皂素含量，%；

m0—— 油茶餅粕質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)茶皂素得率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度＜70%時(shí)，茶皂素得率隨著乙醇濃度的增大而增大；當(dāng)乙醇濃度＞70%時(shí)，茶皂素得率呈下降趨勢(shì)，估計(jì)這是因?yàn)殡S著乙醇濃度的逐漸增加，蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)會(huì)加快凝固，從而導(dǎo)致茶皂素提取得率減少。而低濃度的乙醇會(huì)使得浸提液濃縮十分困難，氣泡現(xiàn)象嚴(yán)重［12］。因此，選擇70%的乙醇作為浸提溶劑比較適宜。

2.2 料液比對(duì)茶皂素得率的影響

由圖3可知，料液比＜1∶8（m∶V）時(shí)，茶皂素得率增幅較大，但之后則增幅較小。盡管高料液比可以提高傳質(zhì)推動(dòng)力，加快浸提速度［13］，但是料液比進(jìn)一步增大，則會(huì)導(dǎo)致浸提液中的溶質(zhì)濃度變低，后續(xù)濃縮難度加大，且造成資源浪費(fèi)。因此，選擇料液比為1∶8（m∶V）左右較為適宜。

圖2 乙醇濃度對(duì)茶皂素得率的影響Figure 2 Effect of ethanol concentration on tea saponin yield

圖3 料液比對(duì)茶皂素得率的影響Figure 3 Effect of ratio of solid to liquid on tea saponin yield

2.3 提取溫度對(duì)茶皂素得率的影響

由圖4可知，提取溫度＜50℃時(shí)，茶皂素得率隨著溫度的增加而增加；提取溫度＞50℃以后，提取得率呈下降趨勢(shì)，估計(jì)這與溫度越高導(dǎo)致乙醇的揮發(fā)損失越大有關(guān)［14］，從而使得提取得率減小。因此，選取提取溫度為70℃較為適宜。

2.4 提取時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響

由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為90min時(shí)，茶皂素得率達(dá)到最大值。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，茶皂素得率有下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過長而導(dǎo)致乙醇不斷揮發(fā)，從而使得茶皂素得率逐漸減小。因此，選取提取時(shí)間為90min左右比較適宜。

圖4 提取溫度對(duì)茶皂素得率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on tea saponin yield

圖5 提取時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響Figure 5 Effect of extraction time on tea saponin yield

2.5 響應(yīng)面法對(duì)醇提油茶餅粕茶皂素的最佳條件優(yōu)化

2.5.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得出的Box－Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Variables and levels of Box－Behnken central composite design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box－Behnken central composite design

對(duì)表2響應(yīng)值與各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，該模型對(duì)應(yīng)的回歸方程為：

經(jīng) Design－Expert 8.0.5b軟件處理，采用二次型進(jìn)行變異分析，二次回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果?Table 3 Result of the regression response surface model

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著 （R2＝0.932 7），模型調(diào)整決定系數(shù)RAdj2＝0.846 2，說明該模型能解釋84.62%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)，試驗(yàn)誤差小［15］。回歸方程的一次項(xiàng)均不顯著，交互項(xiàng)X1X2、X1X3極顯著，說明液料比和提取溫度、液料比和提取時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)茶皂素得率有極顯著的影響。

2.5.2 油茶餅粕茶皂素的醇提工藝條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 經(jīng) Deign－Expert 8.0.5b軟件處理，得到液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）的交互作用的響應(yīng)面及等高線圖見圖6～8。圖中等高線沿各軸方向的變化越密集，其對(duì)相應(yīng)值影響越大［16］。由圖6、7可知，等高線隨著各軸變化的密集程度相當(dāng)，即說明各單因素對(duì)相應(yīng)值影響并不顯著。又因等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圖中等高線均不是圓形，且偏離圓形較大，即說明交互項(xiàng)對(duì)相應(yīng)值影響極顯著［17］。由此可見，此結(jié)果與回歸分析相一致，即液料比和提取溫度、液料比與提取時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)茶皂素的提取得率的影響極顯著。

圖6 液料比和提取溫度對(duì)茶皂素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and the ratio of liquid to solid on yield of tea saponin

圖7 液料比與提取時(shí)間對(duì)茶皂素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of the ratio of liquid to solid and extraction time on yield of tea saponin

圖8 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)茶皂素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and extraction time on yield of tea saponin

根據(jù)所得到的模型，經(jīng) Design－Expert 8.0.5b軟件處理得到的最優(yōu)工藝條件為液料比6.57∶1（V∶m）、提取溫度60℃、提取時(shí)間110min。該條件下，茶皂素提取得率預(yù)測(cè)值為8.36%。考慮到實(shí)際操作的可行性，將料液比修正為7∶1（V∶m）。即最優(yōu)工藝條件為料液比1∶7（m∶V）、提取溫度60℃、提取時(shí)間110min。

2.5.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)條件，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié) 果 分別 為 8.33%、8.34%、8.35%，平 均 值 為8.34%，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化油茶餅粕茶皂素提取條件可行。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化油茶餅粕中茶皂素的提取工藝條件，得到油茶餅粕中茶皂素的最佳提取工藝條件為料液比1∶7（m∶V）、提取溫度60℃、提取時(shí)間110min，在最優(yōu)提取條件下，茶皂素的提取得率可達(dá)8.34%。

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