產(chǎn)柚苷酶高產(chǎn)菌株的篩選

劉藝文 劉素純

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

中國是世界柑橘四大原產(chǎn)地之一，年產(chǎn)量約為1 500萬t，居世界第三。柑橘經(jīng)深加工后會出現(xiàn)明顯的苦味，難以去除。脫除苦味的方法有很多種，如：物理方法、化學(xué)方法等。這些方法都存在各種問題，如：脫苦效率不高、操作復(fù)雜等［1］。利用微生物產(chǎn)生相對應(yīng)的酶來脫除柑橘中的苦味物質(zhì)的方法，不但脫苦效率高，而且還不會影響柑橘特有的風(fēng)味，操作方法也比較簡便，是目前最具有前景和潛力的方法［2，3］。柑橘深加工中主要的苦味物質(zhì)是柚皮苷，柚皮苷的分解酶——柚苷酶的生產(chǎn)國內(nèi)外也早有研究［4～6］，但一直未能應(yīng)用到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，探究其主要原因是因?yàn)槿鄙侔l(fā)酵產(chǎn)酶性能穩(wěn)定的高產(chǎn)柚苷酶菌株。本試驗(yàn)擬從大量腐爛的柑橘內(nèi)篩選出產(chǎn)柚苷酶的高產(chǎn)菌株，為柑橘的深加工提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

橘皮粉：60目，本實(shí)驗(yàn)以湖南石門產(chǎn)色澤光鮮、個體飽滿、成熟度高的柑橘橘皮制備；

脫脂豆餅粉：市售；

豆渣：含水量30%～35%，市售。

1.1.2 主要試劑

柚皮苷：含量98%，美國Sigma公司；

一縮二乙二醇：CP級；長沙化學(xué)試劑公司；

Davis柚苷顯色液（DES）：本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)［7］制備。

其他試劑：AR級，長沙化學(xué)試劑公司。

隨著光電設(shè)備日漸趨于小型化、精密化和高性能化，使其成為可折疊的便于攜帶的產(chǎn)品.因此，對透明導(dǎo)電薄膜質(zhì)量的要求越來越高，進(jìn)而對薄膜制備工藝的要求也越來越高.盡管AgNWs薄膜具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但是如何在高透光率下獲得低的片電阻仍然是一個挑戰(zhàn)，這是亟待解決的問題.AgNWs網(wǎng)絡(luò)的電導(dǎo)性明顯取決于AgNWs之間的連接.以傳統(tǒng)方法制備的AgNWs網(wǎng)絡(luò)存在較大的接觸電阻和接觸穩(wěn)定性問題，不利于電子設(shè)備的精細(xì)化應(yīng)用.為了降低片材電阻，研究人員提出了幾種有效的AgNWs焊接方法，包括激光束焊接[17]、化學(xué)焊接[18]、電阻焊接[19]及冷焊[20]等.

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

（1）斜面培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 5g，橘皮粉10g，K2HPO45g，KCl 5g，F(xiàn)eSO4·5H2O 0.1g，瓊脂粉20g，蒸餾水1 000mL，四環(huán)素片適量，自然pH，0.1MPa蒸汽滅菌20min。

（2）平板篩選培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 5g，橘皮粉10g（在水中煮沸，30min后用紗布過濾）K2HPO45g，KCl 5g，F(xiàn)eSO4·5H2O 0.1g，瓊脂粉20g，蒸餾水1 000mL，四環(huán)素片適量，自然pH，0.1MPa蒸汽滅菌20min。

（3）種子培養(yǎng)基：鼠李糖0.2g，脫脂豆餅粉40g，豆渣（含水量30%～35%）100g蒸餾水1 000mL，0.1MPa蒸汽滅菌20min。

（4）產(chǎn)酶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：鼠李糖0.2g，脫脂豆餅粉40g，豆渣（含水量35%～40%）100g蒸餾水1 000mL，0.1MPa蒸汽滅菌20min，300mL三角瓶裝液量100mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柚苷酶產(chǎn)生菌的分離 從不同地方腐爛的柑橘中采樣20份，每份樣品25g和225mL生理鹽水，適量玻璃珠一起放入無菌的500mL三角瓶中，搖床培養(yǎng)振蕩30min，充分打散菌體后，用10倍稀釋法將菌液稀釋到10－8，將10－4～10－8稀釋液各0.1mL分別涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5d（3d后每天進(jìn)行觀察）。挑選出有明顯菌落特征的平板，并對菌落所在平板進(jìn)行編號，選取生長狀況良好的單個菌落接入斜面培養(yǎng)基，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱。

將DES以相同的厚度滴加在挑選過菌落的平板上，于40℃條件下反應(yīng)20min后，將殘留液體倒去，觀察平板內(nèi)培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)，并對對應(yīng)斜面試管重新編號，篩選出具有產(chǎn)柚苷酶能力的菌株，于0℃冰箱保存。

1.2.2 柚苷酶產(chǎn)生菌的初步篩選 先將分離得到的菌株接種于平板篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5d。再將DES滴加在平板上，40℃恒溫條件下反應(yīng)20min，然后將殘液倒去，這時在平板中柚苷酶產(chǎn)生菌周圍會出現(xiàn)清晰可見的透明圈，測量平板中透明圈的大小，根據(jù)菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小，即可初步判斷菌株產(chǎn)柚苷酶能力的高低，作為下一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。

1.2.4 平板透明圈測定方法 將DES以正好覆蓋整個平板的厚度滴加在挑選完菌落的平板培養(yǎng)基上，40℃恒溫條件下反應(yīng)20min后，將殘留液倒去。如果菌落周圍出現(xiàn)清晰可見的透明圈，說明該菌落有水解柚皮苷的柚苷酶的存在，而柚苷酶酶活的高低由透明圈直徑與菌落直徑之比HC值［8］來確定。

1.2.5 柚苷酶酶活力的測定 采用中林改良Davis法［9］。

1.2.6 粗酶液的制備 發(fā)酵液先經(jīng)棉紗布過濾，后用離心機(jī)8 000r／min離心20min，所得到的上清液即為粗酶液。

1.2.7 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 先配置0.05mg／mL的柚皮苷溶液，分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL柚皮苷溶液于試管中備用，依次加入2.45mL DES，然后用蒸餾水定容至5mL，于30℃水浴保溫30min，在420nm波長下測定吸光度，以吸光度A420對標(biāo)液柚皮苷含量的微克數(shù)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 柚苷酶產(chǎn)生菌的初步鑒定

（1）菌株的菌落特征觀察：無菌操作挑取少量孢子點(diǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基中央，28℃條件下恒溫培養(yǎng)，每隔12h觀察菌落生長狀態(tài)，生長速度和顏色變化。

（2）插片法個體形態(tài)觀察：無菌操作取15mL PDA培養(yǎng)基倒平板，待培養(yǎng)基快凝固后，將0.5mL菌懸液涂布在培養(yǎng)基表面，再以無菌操作用鑷子將無菌蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基內(nèi)，將平板倒置，30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待2d左右開始進(jìn)行個體形態(tài)觀察。用鑷子拔出蓋玻片，將其用棉蘭染色進(jìn)行鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚苷酶產(chǎn)生菌的分離

以橘皮粉為培養(yǎng)基質(zhì)，利用具有產(chǎn)柚苷酶能力的菌落可以和平板培養(yǎng)基發(fā)生顯色反映，形成清晰可見的透明圈的原理，從腐爛的柑橘內(nèi)分離得到150株產(chǎn)柚苷酶的菌株，產(chǎn)柚苷酶的菌株見圖1。

圖1 顯色反應(yīng)后產(chǎn)生透明圈圖Figure 1 The color reaction to produce transparent circle diagram

2.2 菌種初篩結(jié)果

對分離獲得的菌株用平板透明圈法來初步判定產(chǎn)柚苷酶能力的高低，先將每個初篩菌株點(diǎn)接于平板篩選培養(yǎng)基上于30℃恒溫條件下培養(yǎng)3d，通過測量透明圈的直徑和菌落直徑來計算HC值，將HC值大于1.4的菌株進(jìn)行斜面保存，共得到24株產(chǎn)柚苷酶較高的菌株，表1為篩選的到的24個單菌落的HC值，菌株按HC值由高到低排列。

2.3 菌種復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 酶活力的測定采用中林改良Davis法測定，柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.034 8x－0.023 8，R ＝0.998 2（見圖2）。

2.3.2 柚苷酶產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果 通過平板透明圈法中HC值的比較，選取HC值最高的10個菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測定其酶活力，每個菌株設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，酶活力測定結(jié)果見表2。

由表2可知，菌株D7，J9，B1較其他菌株有更高產(chǎn)柚苷酶能力，其中D7菌株產(chǎn)柚苷酶能力最高，其發(fā)酵液酶活力為291.41U，中國國內(nèi)自然篩選柚苷酶菌株其酶活力一般為50～200U［10］，因此認(rèn)為菌株D7有較高酶活力。

2.4 菌種初步鑒定

菌落呈黑色，菌絲短被黑色孢子覆蓋，培養(yǎng)基顏色。氣生菌絲無隔膜；分生孢子梗疏松；有足細(xì)胞；分生孢子梗較粗無分枝，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子為球形，呈黑、黑褐色（見圖3）。

表1 菌落的HC值Table 1 Colonies of HC value

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The standard curve

根據(jù)《真菌鑒定手冊》［11］中關(guān)于黑曲霉的描述，結(jié)合菌落、菌絲和孢子等形態(tài)特征，初步鑒定D7菌株為黑曲霉屬。

3 結(jié)論

透明圈法篩選柚苷酶產(chǎn)生菌，是利用在柚苷酶產(chǎn)生菌周圍能形成清晰可見的透明圈，并且根據(jù)HC值的大小就能初步判定產(chǎn)柚苷酶能力的高低的特點(diǎn)，提高篩菌的效率。以橘皮粉為培養(yǎng)基質(zhì)，對堆積腐爛的柑橘表皮采用稀釋平板法和透明圈法篩選出一株柚苷酶生產(chǎn)菌株D7。通過菌落和形態(tài)特征觀察并對照《真菌鑒定手冊》上關(guān)于黑曲霉的描述，初步鑒定為黑曲霉。對該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測其酶水平達(dá)到291.41U，該菌株具有較強(qiáng)的降解柚皮苷能力。

表2 復(fù)篩菌株的柚苷酶酶活力Table 2 Naringinase activities of repeated screening strains

圖3 菌株D7培養(yǎng)3d的菌落形態(tài)和個體形態(tài)（放大倍數(shù)400）Figure 3 Colony of D7cultivated 3dand individual morphology under the microscope（magnification＝400）

1 姚輝.產(chǎn)柚苷酶菌株的選育及柚子汁酶法脫苦工藝的研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

2 曾凡坤，鄒連生，焦必林.柑桔中類檸檬苦素含量及分布研究［J］.中國食品學(xué)報，2003（4）：8～11.

3 單楊，李高陽.現(xiàn)代生物技術(shù)在柑橘工業(yè)應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2007，23（5）：141～144.

4 張怡，曾紅亮，姚輝，等.柚苷酶產(chǎn)生菌的分離篩選及鑒定［J］.中國食品學(xué)報，2012，12（2）：196～201.

5 張怡.福建特產(chǎn)柚子加工及綜合利用技術(shù)的研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

6 楊昌鵬.酶制劑的生產(chǎn)與應(yīng)用［M］.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2006.

7 郭倩.產(chǎn)柚苷酶高產(chǎn)菌株的篩選，鑒定及產(chǎn)酶特性研究［D］.成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

8 Palm Banerjee S.Production，purification and characterization of the debittering enzyme naringinase［J］.Biotechnology Advances，2000，18：207～217.

9 吳長慶.柑橘果汁中的苦味物質(zhì)及其去除方法［J］.中國商辦工業(yè)，2000（2）：53～54.

10 Munish Puri，Sukirti Kalra.Purification and characterization of naringinase from a newly isolated strain of Aspergillus nigerl 344for the transformation of flavonoids［J］.World Journal of Microbiology Biotechnology，2005（21）：753～758.

11 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科技出版社，1979.