煙葉中多糖的分離及單糖組成

舒俊生 田振峰 陳開波 毛 健

（1.安徽中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心，安徽 合肥 230088；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

多糖是由多個相同或不同的單糖基以糖苷鍵相連而形成的高聚物，在自然界分布極廣［1－4］。多糖在煙草物理保潤性能方面具有重要的作用［5－7］，對煙草的感官品質(zhì)和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性也具有較強(qiáng)影響［8，9］。但是，目前有關(guān)煙葉多糖提取分離的研究卻較少，朱小平等［10］對煙草水溶性多糖進(jìn)行過分離純化分析研究，認(rèn)為煙葉多糖是以半乳糖醛酸為主，兼含阿拉伯糖、木糖等雜多糖，而未對多糖的單糖組成及比例做進(jìn)一步試驗證明。離子色譜法是目前研究糖類化合物中單糖組成及比例不可缺少的手段，且具有較高的靈敏度和精密度。因此，本研究擬對煙葉中的多糖進(jìn)行提取、分離，并采用離子色譜法對其組成的單糖進(jìn)行分析，以期為煙草的保潤性能評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

煙葉：品種 K326，等級 B2F（上部煙葉）、C3F（中部煙葉）、X2F（下部煙葉），采自云南陸良地區(qū)。

1.2 主要試劑

無水乙醇、正丁醇、氯仿、乙醚、丙酮、氯化鈣、苯酚、1－萘酚、碳酸鋇、濃硫酸：分析純，上海國藥集團(tuán)；

阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖：色譜純，美國Fluka公司。

1.3 主要儀器

離子色譜儀：DIONEX ICS3000型，美國戴安公司；

離心機(jī)：SIGMA2－16K型，德國Sigma公司；

超聲波發(fā)生器：SONIFIER 450型，美國Branson公司；

冷凍干燥機(jī)：ALPHA型，德國Sigma公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理 烤煙樣品（不同樣品來源的上、中、下部煙葉）在40℃烘2h，粉碎后過40目篩。稱取10g煙末，用100mL 80% 乙醇、30℃超聲輔助提取3次，每次0.5h。離心分離除去上層清液，殘渣風(fēng)干后用于多糖提取。

1.4.2 多糖提取工藝

（1）提取：將預(yù)處理后的煙末殘渣，加100mL蒸餾水，30℃超聲輔助提取，每次0.5h，重復(fù)3次。每次提取后，5 000r／min離心5min，得上清液，合并3次上清液。

（2）脫色：由于煙葉多糖提取液顏色呈深褐色，故對提取液進(jìn)行脫色。向混合后的提取液中加入10g活性炭，50℃下攪拌0.5h，5 000r／min離心5min，得澄清液。

（3）去果膠：向得到的澄清液中加入10%的CaCl2，靜置過夜，離心（5 000r／min，5min）去除果膠。將澄清液于65℃真空濃縮至原體積的1／5，加入5倍濃縮液體積的無水乙醇溶液，－20℃冷凍靜置過夜，離心得白色沉淀。

（4）脫蛋白：沉淀用蒸餾水溶解，Sevage法去蛋白，按多糖溶液∶氯仿∶正丁醇＝2∶0.2∶0.04的比例在分液漏斗里振蕩，4 500r／min離心5min，反復(fù)多次。再加入4倍體積的無水乙醇溶液，－20℃冷凍靜置過夜，離心得白色沉淀。

（5）干燥：沉淀加無水乙醇混勻，離心，重復(fù)操作3次；分別用丙酮、乙醚各洗滌3次，50℃真空干燥。最后得白色塊狀煙葉多糖。

1.4.3 煙草多糖含量 按式（1）計算：

1.4.4 多糖樣品的分析

（1）碘－碘化鉀反應(yīng)：取1mL煙葉多糖樣品制成的溶液，加入碘－碘化鉀溶液中，觀察顏色變化。

（2）考馬斯蘭顯色反應(yīng)：取1mL煙葉多糖溶液，加入0.5mL 0.1%的考馬斯蘭乙醇溶液，混勻，煮沸1～2min，冷卻，觀察顏色變化。

（3）Molish反應(yīng)：取1mL煙葉多糖溶液，加入2滴Molish試劑，搖勻，沿試管壁慢慢加入1mL濃硫酸，觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化。

1.4.5 離子色譜法分析多糖的單糖組成 各取少量干燥上、中、下部煙葉提取的多糖樣品，加入1.0mol／L 的H2SO4溶液2mL，60℃水浴水解6h，冷卻后，加入BaCO3中和，4 500r／min離心除去BaSO4沉淀，得上清液，稀釋至100mL，用0.2μm的一次性濾頭過濾，直接采用離子色譜進(jìn)行多糖的單糖組成分析。單糖的定性分析采用與標(biāo)準(zhǔn)單糖色譜保留值相對照的方法，單糖含量采用定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得。先配制一定濃度的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖溶液，然后稀釋，進(jìn)樣，得到單糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對水解后樣品中單糖含量進(jìn)行測定。

色譜條件：陰離子交換柱：CarboPac PA－1；柱溫：30℃；流動相：25mmol／L；NaOH 流量：0.25mL／min；等梯度進(jìn)樣；進(jìn)樣量：10μL；檢測器：ED50；工作電極：金電極；參比電極：Ag／AgCl參比電極。

1.4.6 紅外光譜測定 采用Necolit 5D×B型紅外光譜儀進(jìn)行測定。KBr壓片，掃描范圍：4 000～400cm－1，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4cm－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉多糖含量測定

分別稱取B2F、C3F、X2F 10g，經(jīng)過提取、脫蛋白去果膠后，測定多糖重量。上、中、下部煙葉粗多糖量分別為1.01，0.74，0.72g。上、中、下部煙葉粗多糖的提取率分別為10.13%，7.36%，7.18%。煙葉部位對多糖的影響規(guī)律與茶葉多糖的部位分布規(guī)律類似［11］。從上部到下部，煙葉多糖含量，呈下降趨勢。

2.2 煙草多糖純度鑒定

多糖樣品水溶液中滴入碘－碘化鉀溶液，顏色沒有變化，說明溶液中不含淀粉；滴入考馬斯蘭溶液后，為亮藍(lán)色，說明不含蛋白質(zhì)；加入 Molish試劑后，在兩層液面間形成紫色環(huán)，說明樣品含有多糖。

2.3 離子色譜分析單糖組成

圖1為標(biāo)準(zhǔn)單糖含量測定的離子色譜圖；圖2～4分別為上、中、下部煙草多糖水解后單糖含量測定的離子色譜圖。試驗結(jié)果表明，所取煙葉所含多糖主要組成單糖是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和果糖。這4種單糖的摩爾比組成：上部煙葉為38∶0.6∶4.5∶6.1；中部煙葉為22.7∶0.6∶3.2∶2.5；下部煙葉為17.4∶0.6∶2.5∶1.8。不同部位煙葉的多糖中，阿拉伯糖為主要成分，這與朱小平的研究結(jié)果不同［9］，可能與其沒有脫除果膠有關(guān)。此外，煙草多糖中單糖組成與其它植物多糖和菌類多糖差異顯著［12－14］。

2.4 煙葉多糖紅外光譜分析

圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖分離的離子色譜圖Figure 1 Ion chromatogram of standard monosaccharide

圖2 上部煙葉多糖水解后單糖分析的離子色譜圖Figure 2 Ion chromatogram of monosaccharide from the upper leaf polysaccharide

圖5是上部煙葉多糖樣品在4 000～400cm－1區(qū)的紅外吸收光譜。由圖5可知，上部煙葉具有多糖類物質(zhì)的一般特征伸縮振動峰。紅外檢測結(jié)果顯示，上、中、下部煙葉粗多糖的紅外光譜圖完全一致。3 399cm－1附近的強(qiáng)吸收峰是糖分子中羥基的伸縮振動吸收峰；2 925cm－1附近的吸收峰是C－H的伸縮振動峰；在1 641cm－1左右的峰是多糖水合振動峰；1366，1243cm－1附近的吸收峰是C－H的變角振動峰；1 163，1 077，1 038cm－1處的強(qiáng)吸收峰為吡喃糖環(huán)羥基的變角振動吸收峰，說明煙葉多糖的單糖以吡喃糖苷的形式存在。1 730cm－1附近沒有糖醛酸的特征吸收，這與離子色譜糖醛酸含量測定結(jié)果一致，表明煙葉多糖可能為一中性雜多糖。此外，由于844，891cm－1處未出峰，不能判斷煙葉多糖的糖苷鍵連接類型。

圖3 中部煙葉多糖水解后單糖分析的離子色譜圖Figure 3 Ion chromatogram of monosaccharide from the middle leaf polysaccharide

圖4 下部煙葉多糖水解后單糖分析的離子色譜Figure 4 Ion chromatogram of monosaccharide from the lower leaf polysaccharide

圖5 上部煙葉多糖的紅外吸收光譜Figure 5 Infrared chromatogram of the upper leaf polysaccharide

3 結(jié)論

本研究對煙草中的多糖進(jìn)行了提取，經(jīng)活性炭脫色、氯化鈣去果膠、Sevage法除蛋白質(zhì)、脫脂處理后，冷凍干燥得到粗多糖。然后利用離子色譜對多糖的水解產(chǎn)物中單糖的種類和比例進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，煙葉部位對多糖含量有顯著影響，上部煙葉多糖含量明顯高于中部和下部煙葉。煙葉多糖主要單糖組成是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和果糖，這些單糖以吡喃糖苷的形式存在。

1 Paliwal R，Rawat A P，Rawat M，et al.Bioligninolysis：recent updates for biotechnological solution［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，167（7）：1 865～1 889.

2 Nelson E D，Ramberg J E，Best T，et al.Neurologic effects of exogenous saccharides：a review of controlled human，animal，and in vitro studies［J］.Nutr Neurosci，2012，15（4）：149～162.

3 Vera J，Castro J，Gonzalez A，et al.Seaweed polysaccharides and derived oligosaccharides stimulate defense responses and protection against pathogens in plants［J］.Mar Drugs，2011，9（12）：2 514～2 525.

4 黃秀香，覃玥，黃艷梅.半枝蓮多糖提取工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2013，29（2）：126～129.

5 毛智慧，湯建國，楊繼，等.煙草中水溶性糖的超高效液相色譜分析及聚類分析研究［J］.分析實驗室，2011，30（3）：115～118.

6 黃菲，黃翼.高效液相色譜法測定煙草及煙草制品中的三種水溶性糖［J］.中國煙草科學(xué)，2012，33（2）：47～51.

7 國家煙草專賣局科技教育司，中國煙草科技信息中心.煙草：生產(chǎn)，化學(xué)和技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：376～381.

8 劉洋，劉珊，胡軍，等.仙人掌多糖的提取及其在卷煙中的應(yīng)用［J］.煙草科技，2010（10）：8～11.

9 許春平，楊琛琛，高建奇.天然多糖的提取及其在卷煙中應(yīng)用述評［J］.鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，27（5）：34～37.

10 朱小平，陶樂平.煙草水溶性多糖的分離、純化、組成及其部分性質(zhì)的研究［J］.中國煙草學(xué)報，1993（1）：8～12.

11 陳玉瓊，余志，張蕓，等.茶樹品種、部位和嫩度對茶多糖含量和活性的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，24（4）：406～409.

12 林雪，賈敬芬，黃琳娟，等.RP－HPLC用于蘆薈多糖的單糖組成研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（4）：192～195.

13 向東，梁平，賴鳳英.南瓜多糖的理化性質(zhì)及單糖組成［J］.食品工業(yè)科技，2004（12）：62～63.

14 李健，劉寧，陳平，等.香菇多糖單糖組成及含量的測定方法研究［J］.化學(xué)與黏合，2005，27（2）：71～74.